猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起以妊娠母猪繁殖障碍以及仔猪和生长育肥猪呼吸道症状和高死亡率为特征的猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS),给世界养猪业造成了巨大的经济损失。尽管对PRRSV致病机制进行了广泛的研究,取得了一系列有重要意义的成果,但由于该病毒本身的高变异性及其与宿主之间复杂的作用机制,使得传统的治疗方法和疫苗预防不能有效控制疾病发生。因此对PRRSV与宿主相互作用机制的深入研究以及新型化学药物的研发对该病的有效控制有着重要的意义。本研究主要对氯化锂(LiCl)抗PRRSV活性进行了评估并对其作用机制进行了探讨。主要研究内容包括:1 LiCl抗PRRSV感染效果的研究通过Western Blot、Q-PCR、空斑实验等方法在MARC-145细胞上对LiCl的抗病毒活性及其机制进行研究。Western Blot和Q-PCR结果表明,LiCl能够在蛋白水平和RNA水平上有效地抑制PRRSV感染,且抑制效果具有剂量依赖性。空斑结果同样证明了LiCl对PRRSV感染的抑制效果。LiCl预先处理病毒粒子或者宿主细胞对病毒感染没有抑制效果,说明LiCl的抗病毒效果并不是通过改变病毒粒子或影响病毒粒子入胞产生的。进一步结果表明LiCl对PRRSV的释放与组装没有影响。2 Wnt途径与LiCl抗病毒效果关系的研究通过Western-blot、激光共聚焦、RNA干扰、药物抑制以及双荧光素酶报告基因系统等方法研究Wnt途径在LiCl抗PRRSV过程的具体作用机制。作为Wnt信号途径中的组成成分以及LiCl在生物机体内最重要的作用底物之一的GSK-3β调节着众多生理过程,本章中对GSK-3β与病毒复制的关系进行了研究。之前的研究表明LiCl能够抑制GSK-3β的活性,为了探究LiCl是否通过降低GSK-3β活性而抑制PRRSV的复制,我们利用GSK-3β特异性抑制剂GSK-3βinhibitorⅡ处理感染过PRRSV后的MARC-145细胞,然后通过Western-blot检测PRRSV N蛋白表达水平的变化。结果表明,GSK-3β抑制剂并不能对PRRSV感染产生明显的抑制效果。为了进一步探究GSK-3β活性对PRRSV复制的影响,我们利用RNA干扰方法减低细胞内GSK-3β的表达,结果证明,GSK-3β表达水平的降低对PRRSV感染未产生明显的抑制效果。为了探究GSK-3β在PRRSV复制过程中的作用,我们还利用紫外线灭活过的病毒以及未灭活过的病毒感染MARC-145,通过Western-blot检测其β-GSK-3β(ser9)磷酸化水平。结果表明灭活过的病毒不能增加p-GSK-3β(ser9)磷酸化水平,这说明GSK-3β的磷酸化与病毒的吸附和入胞无关,而与病毒的复制有关。此外我们还分析了在病毒感染24h内LiCl以及病毒感染对细胞内p-GSK-3β(ser9)磷酸化水平的影响。结果证明,LiCl能引起比病毒感染更强烈的p-GSK-3β(ser9)磷酸化水平。通过Western-blot方法对Wnt途径中β-catenin以及c-Myc蛋白表达水平的检测发现,虽然PRRSV与LiCl同样能够引起p-GSK-3β(ser9)磷酸化水平的升高,但是PRRSV感染却不能引起β-catenin以及Wnt途径目的基因之一的c-Myc水平的升高,而LiCl本身能引起MARC-145内β-catenin水平的显著升高,更重要的是LiCl能够在PRRSV感染的MARC-145内引起β-catenin水平的以及Wnt途径下游基因c-Myc的升高。这表明LiCl能在PRRSV感染的细胞内激活Wnt途径。为了进一步研究LiCl是否能在感染PRRSV的细胞内引发β-catenin的核转移及Wnt途径的激活,我们通过激光共聚焦观察了β-catenin在PRRSV感染细胞内以及LiCl处理的细胞内的分布情况。结果表明,LiCl能够明显刺激β-catenin的入核,而PRRSV的感染不能明显的促进β-catenin入核。在Wnt经典途径;中,β-catenin入核后会与转录因子Tcf/Lef家族成员结合,从而激活包括c-Myc在内的多种基因的表达。通过双荧光素酶报告基因系统,我们证明了LiCl能显著增强感染细胞内Tcf/Lef因子的转录活性,而PRRSV感染却不能增加其转录活性。以上数据表明LiCl可以通过促进感染细胞内β-catenin的积累,从而促进其入核以及增强转录因子Tcf/Lef的转录活性。PRRSV感染没有引起β-catenin表达量的增多及核转移。最后,为了探究LiCl是否通过激活Wnt信号通路抑制PRRSV复制,我们利用RNA干扰技术以及Wnt信号通路抑制剂,对LiCl的抗病毒活性进行了评估。结果表明,两者均能逆转LiCl的抗病毒效果,这说明LiCl通过激活Wnt途径来起到抗病毒效果,而抑制Wnt途径则能减弱LiCl对PRRSV复制的抑制效果。3 LiCl抑制PRRSV诱导的炎症反应及其作用机制的研究研究中我们主要对LiCl的抑制促炎症因子表达及作用机制进行了研究。通过实时荧光定量PCR方法,我们分析了在PRRSV感染6h、12h、18h、24h后促炎症因子(白细胞介素-6、白细胞介素-8以及白细胞介素-1β)在MARC-145细胞以及PAM细胞中的基因变化,以及感染后加入LiCl对它们表达的影响。结果显示,在MARC-145和PAM中LiCl均能明显抑制PRRSV引起的促炎症因子的基因表达。尤其是在感染18h后的抑制作用更加明显。为了研究LiCl抗炎作用的作用机制,我们利用Western-blot检测处理过后的MARC-145细胞内NF-κB信号通路的变化。结果表明,PRRSV在感染24h后能够通过抑制IκB的蛋白水平增强NF-κB的磷酸化水平。在加入LiCl的感染细胞内,NF-κB的磷酸化水平明显受到抑制。NF-κB作为体内重要的转录因子,其入核后能激活大量目的基因的表达,尤其是对促炎性因子基因的表达有着重要的作用。因此为了探究LiCl抑制促炎性因子分泌的的机制,我们利用激光共聚焦荧光免疫方法,观察LiCl在PRRSV感染细胞内对NF-κB入核情况的影响。结果显示,PRRSV的感染能够明显激活NF-κB的入核,而LiCl处理的感染细胞内,入核的情况受到明显的抑制。此外在PRRSV感染MARC-145后用Wnt途径抑制剂PNU74654以及LiCl处理24h后,通过实时荧光定量分析发现,Wnt抑制剂能够明显提高PRRSV感染引起的IL-6、IL-8、IL-1β基因水平的升高,而Wnt激活剂LiCl则能明显抑制PRRSV感染引起的IL-6、IL-8、IL-1β基因的表达。这表明Wnt途径可能在PRRSV感染过程中对IL-6、IL-8、IL-1β基因的表达具有负调节作用。以上结果表明LiCl能够有效抑制PRRSV感染引起的IL-6、IL-8、IL-1β基因水平的升高,其作用机制主要是通过激活Wnt途径抑制NF-κB的磷酸化以及入核情况,从而最终抑制IL-6、IL-8、IL-1β基因的表达。