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鸭病毒性肝炎（Duck viral hepatitis, DVH）是由鸭病毒性肝炎病毒（Duck hepatitisvirus, DHV）引起的一种急性、高致死性传染病；以肝炎为主要特征，主要发生在三周龄以内雏鸭。我国鸭病毒性肝炎主要是由DHAV-1和DHAV-3引起的，雏鸭感染这两种病毒后的临床症状和病理变化极其相似，并且二者在临床上混合感染比较普遍，给该病的有效诊断和防治带来了极大困难。DHAV-1和DHAV-3共同流行是我国许多鸭场采取针对传统基因型主动或被动免疫仍发生鸭病毒性肝炎的主要原因。本研究成功构建了DHAV-3SD1101株全长cDNA感染性克隆，并对其部分生物学活性进行了研究。1、DHAV-3SD1101株感染性克隆的构建及病毒的拯救在本实验室已完成的SD1101株DHAV-3全基因组测序基础上，根据载体pCDNA3.1+与病毒全基因组序列的酶切图谱，设计并合成四对特异引物，应用融合PCR技术分四段扩增DHAV全基因组cDNA，分段克隆到载体pCDNA3.1+中，获得了DHAV-3SD1101株基因组全长cDNA克隆pSDDHAV。通过引物设计的方法，在cDNA的5’端添加上sp6RNA聚合酶启动子核心序列和3’端添加病毒基因组序列中不存在的单一酶切位点BssHⅡ。另外设计两对引物，用于突变一个EcoRⅠ酶切位点作为遗传标签，用以区分母本病毒和拯救病毒。将SD1101株全长cDNA按一定顺序拼接到pCDNA3.1+上，从而获得重组质粒pSDDHAV，测序后发生突变的碱基共有6位，其中第7190位碱基为人工诱变，用于突变EcoRⅠ酶切位点作为遗传标签。碱基变异共造成第224和2397位氨基酸发生改变，其余均为无义突变。用BssHⅡ线性化重组质粒pSDDHAV后体外转录，沉淀回收转录产物用于转染BHK-21细胞，并用母本病毒RNA作为阳性对照，用灭菌PBS作为阴性对照。转染BHK-21细胞盲传三代后收获细胞及上清液，用RT-PCR和IFA方法检测结果均为阳性。经过遗传标记的鉴定，表明成功获得了拯救病毒。2、拯救病毒的部分生物学活性研究取收获的细胞及上清液，反复冻融后接种8日龄鸭胚，传至第三代鸭胚开始出现死亡，取第五代尿囊液测定拯救病毒和母本病毒的DELD50。结果显示DHAV-3rSD1101株第五代病毒尿囊液对8日龄鸭胚的DELD50为5-2.40/0.2mL；DHAV-3SD1101株第五代病毒尿囊液对8日龄鸭胚的DELD50为5-2.50/0.2mL。为了探究拯救病毒的感染性，将30只1日龄的健康雏鸭随机分成三个组。其中1、2组分别肌肉注射0.5mL（2DELD50）的拯救病毒和0.5mL（2DELDD50）母本病毒，对照组肌肉注射相同剂量的无菌pH7.4的PBS。结果显示拯救病毒具有与母本病毒相似的感染性，接种雏鸭表现出明显鸭病毒性肝炎临床症状。本研究成功构建了具有感染性的DHAV-3全长cDNA克隆，为进一步揭示DHAV基因组结构与功能及致病机理等提供了良好的技术平台。