实验目的探讨利用脂多糖构建大鼠急性肺损伤动物模型方法的可行性。探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)的分离、培养、扩增、鉴定,分析其在损伤肺部的分布和定植情况,以及对损伤肺的修复作用。探讨应用干细胞治疗严重肺部疾病的可能性,为临床上利用干细胞方法治疗严重肺部疾病提供参考。实验方法选用6周龄健康Wistar大鼠(约150克),无菌条件下分离股骨胫骨,冲出骨髓于离心管中,反复加入L-DMEM培养基,并吹打制成细胞悬液,离心,弃上清。用L-DMEM 3mL重悬细胞,将悬液贴壁加入到预置Percoll分离液的离心管中,离心。收集云雾状白膜层的单个核细胞,用L-DMEM洗涤,用L-DMEM培养基重悬。接种后24时首次换液,以后每3天换液,8-12天达到80～90%融合时消化传代。取2代BMSCs以2×10~4传代于24孔板中,免疫荧光法检测细胞CD29、CD44、CD34、CD45表面标志,荧光显微镜下观察并照相。20只大鼠分为两组,一组经尾静脉注入脂多糖,另一组经尾静脉注入脂多糖和经氟尿嘧啶标记的骨髓间充质干细胞。另有2只大鼠:1只为正常对照,1只为干细胞对照。观察比较大鼠呼吸状态,呼吸频率,活动状态,摄食情况,口鼻分泌物情况。5d后通过放血法统一处死实验动物,留取肺组织标本行病理组织学检查,并进行分析比较。实验结果1、原代培养的大鼠骨髓间充质干细胞一般9-10天即可长到80-90%融合,第2代后细胞的形态比较均一。2、免疫荧光法检测BMSCs,CD29、CD44呈阳性反应,CD34、CD45呈阴性反应。3、正常对照和干细胞对照大鼠呼吸状态及活动性良好。A、B两组均有部分大鼠呼吸困难,呼吸频率加快,不活动和不进食,口鼻有粉红色分泌物。但A组数量更多,呼吸频率加快更明显,经统计学分析,两组差异有统计学意义(P＜0.05)。4、正常对照和干细胞对照大鼠肺脏无异常。大体观察显示,A、B两组大鼠肺脏均出现不同程度淤血水肿,但A组程度更重,且有3只大鼠肺脏出现了肉眼可见的实变改变。A组大鼠肺脏病理切片显示,肺组织出现了明显的水肿,充血,甚至肺实变的情况;B组大鼠肺脏病理切片显示,肺组织也出现了水肿和充血情况,但其程度较轻,且没有肺实变情况发生。5、A组大鼠肺脏病理切片,免疫组化染色呈阴性;B组大鼠肺脏病理切片,免疫组化染色呈阳性。结论1、经外源性骨髓间充质干细胞治疗干预的急性肺损伤的大鼠肺脏病理改变与对照组相比有所减轻。2、外源性骨髓间充质干细胞在急性肺损伤的大鼠肺脏中可归巢定植。