论文部分内容阅读
前言 中风是由于脑血管堵塞引起局部脑缺血，受影响组织血流量严重减少导致氧及养分运送的不足，引起组织缺氧和细胞死亡。新近发现有一潜在机理即通过诱导血管生成提高受影响组织氧的浓度以减少这些有害因素的影响．血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)和低氧诱导因子-1(Hypoxia-in-ducible factor-1，HIF-1)就是倍受关注的二个生物因子。 迄今为止有能力参与血管生成因子中血管内皮生长因子(VEGF)是最好的调节内皮细胞生长、分化的特异性候选基因，又称血管通透性因子(vascular permeability factor，VPF)。VEGF基因是一个二聚体糖蛋白，具有促内皮细胞有丝分裂和提高血管的渗透性作用。研究表明，低氧是VEGF mRNA表达强的诱导剂，在体外各种器官细胞包括体内大脑和各种缺血模型可见VEGF mRNA表达。 体外研究表明，暴露于低氧的细胞存在一些机制即在生物学上通过升高的HIF-1介导VEGF分泌的增多，在分子水平是通过基因VEGF 5’侧翼区域与HIF-1的HRE结合来实现的。HIF-1是在低氧条件下诱导的一种异二聚体结合DNA的蛋白质因子，主要由低氧调节的α亚基、β亚基组成。 目前脑缺血后两个因子时间动力学和组织学分布数据还未获得，它们在空间、时间上的相关性及协同性还不了解。因而，我们应用大鼠大脑中动脉缺血再灌模型，从蛋白及核酸水平研究二指标的关系。 实验材料与方法 1．实验动物及分组：健康雄性Wstar大鼠50只，均由中国医科大学动物实验中心提供，实验前体重K70 t 10）克。随机分成免疫组化方法试验组和RT－PCR方法试验组两个试验组组成：①免疫组化组一一5组人5组分别对应有假手术组、局灶脑缺血再灌 4h组S 组在4h组和 72h组等时间点，每个时间点 n＝5；②RT－PCR组门J组人5组同免疫组化组，即分别对应有假手术组。局灶脑缺血再灌4h组／ 组在4h组和72h组等时间点，每个时间点 n＝5。 2．方法：采用Zea onga改良的动脉线栓法制备大鼠局灶脑缺血再灌模型，大鼠于 MCA阻断2小时，按再灌注不同时间即 4h。sh＊4h、72h等时间点断头取脑。 门）免疫组化各组大鼠在规定的时间用10％水合氯醛麻醉，4％多聚甲醛一0．of MPBS液uH值 7．4）固定后取材，石蜡包埋，连续切片，常规HE染色切片；免疫组织化学SABC法检测VEGF。HIF－la蛋白。应用 M，tanlomh Imaging System V4．6软件分另测定VEGF0IF－la阳性反应物平均面密度值，对各时间点 VEGF、HIF－la免疫组化阳性细胞与假手术组比较定量分析，进行方差检验。 沁）①R丁一PCR各组在规定的时间迅速断头取脑，剥取半暗带的脑皮质组织于一72℃冰箱中冻存；②大鼠脑组织总RNA的提取：取 100mg组织加人 IInl Tizol试剂，具体参照试剂说明书；③逆转录反应：将提取的 RNA逆转录成CDNA；④PCR扩增：以 CD－NA为模板，选择相应的引物，扩增 VEGF－A及 HIFl 基因片段；以p－actin作为内对照；⑤PCR扩增产物检测和半定量分析：取PCR产物进行2％琼脂糖电泳，进行早期摸索条件分析，勺％聚丙烯酸胺凝胶电泳检测PCR扩增产物，摄下并保存图象，采用 ·2·nuonhem VZ．0 Stand Alone自动分析软件，对电泳图象的目的基因和内对照p－actin的扩增产物条带分别进行分析。通过计算，对目的基因的表达进行半定量分析。免疫组化组及RT－PCR组分别与其假手术组比较，进行方差检验。 结 果 （l）VEGF蛋白检狈： 假手术组：大鼠脑组织脉络丛可见VEGF阳性表达细胞，其余组织偶见VEGF阳性表达。缺血再灌4h＄ 组：大鼠脑MCA供血区皮质神经元VEGF阳性表达细胞增多，且软脑膜可见VEGF蛋白表达，其中缺血再灌4卜组与假手术组比较阳性表达细胞无显著性差异门＞O．05人而缺血再灌sh组与假手术组比较阳性表达细胞有显著性差异瞩＜0刀5入24 h达高峰，72h降近基线，而软脑膜表达 VEGF持续至 72h，阳性表达主要位于胞浆内。 （2）VEGF－A mRNA检测： 假手术组：可检测VEGFm。、VEG；64表达，以VEGF；64表达为主；缺血再灌4h组：VEGFM。、VEGF；。、VEGF口。编码mRNA的3个转录子表达均升高或出现，sh组增高明显，3个转录子于 24h达高峰，72h降近基线，其中VEGF1s卜VEGFl。缺血再灌sh上4h组表达有统计学意义瞩＜0．0引，余均无统计学意义河＞O．05人 缺血再灌各时间点VEGF在mRNA及蛋白水平呈一致性表达，在mRNA水平可见VEGF；朋、VEGF；。、VEGF；儿编码mRNA的3个转录子表达，以 VEGF；。表达为主，VEGF；。表达趋势相同，但与假手术组比较变化无统计学意义。 O）HIF－la蛋白检测：假手术组及缺血再灌 4h组：在大鼠脑组织仅见少量 HIF上 阳性表达细胞，而软脑膜未见 HIFl 阳性表达，再灌 sh组：在大鼠脑 MCA供血区皮质神经元可见＊F－la ·3·阳性表达细胞增多，24h达高峰，72h降近?