植物作为固着生物,其生长发育受到干旱、高盐、冷/热胁迫和营养元素缺乏等非生物逆境胁迫的严峻考验。植物感受逆境胁迫信号后,通过一系列信号转导,对不利于自身生长的环境因素做出相应的应答和抵御。其中,激酶/蛋白磷酸酶介导的磷酸化/去磷酸化和转录因子是响应逆境胁迫信号转导的重要调节机制。本研究分析了玉米中两个应答非生物胁迫基因的分子特征以及它们在玉米抵御逆境环境时的作用。包括一个响应低磷胁迫的蛋白磷酸酶2A的A亚基基因ZmPP2AA1,和一个响应干旱、高盐胁迫及离子毒害的转录因子NF-YA基因ZmNF-YA1。过表达ZmPP2AA1提高了玉米低磷耐受性玉米是重要的粮饲作物兼工业原料,在农业经济中占有重要地位。土壤中的磷储存很多,但是由于磷对土壤中的金属离子亲和力高,易形成复合物,因此植物可吸收利用的无机磷严重不足。向农田中施入大量的可溶性磷肥可使作物增产,但该措施不仅加大成本而且污染环境。因此,了解植物适应低磷环境的机制,利用并改良作物自身固有的高效利用土壤磷素的生物学特性,开发高效利用磷营养新品种,对于农业、经济及环境具有深远意义。根系是吸收磷素的主要器官,已有多项成功案例关于通过改良植物根系构型获得低磷耐受性的植物。本实验室对低磷培养的玉米根进行转录组及磷酸蛋白组分析中发现,有2个PP2A的亚基基因受低磷诱导表达,一个催化亚基的蛋白丰度在低磷胁迫时发生动态变化,推测它们的表达水平变化可能与低磷信号传导相关。本工作中,我们发现玉米根中ZmPP2AA1的转录受低磷胁迫后上调表达。为了明确ZmPP2AA1在玉米低磷耐受性中的作用,我们通过基因工程手段在玉米骨干自交系Qi-319中过表达ZmPP2A41和通过RNAi干扰方法降低ZmPP2AA1的表达水平,比较不同转基因纯合系植株在足磷/低磷条件下的形态差异和生理生化的变化,进而探究ZmPP2AA1在调节玉米生长发育和低磷耐受性中的生物学功能及其作用机制。观察足磷水培条件下的ZmPP2AA1转基因玉米和野生型对照自交系Qi-319(WT)的表型,发现过表达株系的初生根发生卷曲、轴生根的伸长受到抑制,而RNAi株系的初生根垂直生长、轴生根的伸长受到促进。ZmPP2AA1过表达株系的侧根密度和侧根长度显著高于WT的,ZmPP2AA1RNAi株系则表现出相反的趋势。这些结果表明,ZmPP2AA1调节玉米初生根的向重性及生长,且正向调控侧根的形成和伸长。根系构型的改变是响应低磷环境的典型表型。玉米ZmPP2AA1过表达、RNAi植株和WT在足磷(SP)或低磷(LP)条件下水培15天后,比较分析各基因型植株的根系形态参数,发现在低磷条件下过表达ZmPP2AA1增加了玉米轴生根数目,刺激了侧根的产生,形成了一个更为发达的根系,显著增大了活性吸收面积。而ZmPP2AA1 RNAi株系中轴生根的数目与野生型的无差异、但长度增加,侧根密度降低,活性吸收面积减小。因此,玉米体内ZmPP2AA1基因表达水平的变化可影响低磷胁迫介导的根系构型变化。在遭受低磷胁迫时,过表达ZmPP2AA1植株延迟和减少了花青素的积累,积累了较多的干物质。而ZmPP2AA1RNAi株系无论在足磷还是低磷环境下,其地上、地下部分的干重都显著低于WT的。低磷环境下ZmPP2AA1过表达植株积累了更多的磷素,而RNAi株系的磷积累显著低于WT的。这与它们的磷吸收能力成正比。无论在SP或LP条件下,过表达株系具有更高的Imax值;在低磷胁迫时,其Km值和Cmin值显著低于WT的;而ZmPP2AA1 RNAi的Km值和Cmin值显著高于WT的。即在遭遇低磷环境时,过表达ZmPP2AA1玉米植株的根系对磷的亲和力更高,吸收磷的能力更强。过表达植株体内积累较多的磷可缓解低磷胁迫对其生长的抑制作用,因此表现出较好的低磷耐受性。在遭受长期磷缺乏时,过表达ZmPP2AA1植株的生殖器官发育较好,籽粒产量较高。在玉米中过表达ZmPP2AA1可显著提高植株对低磷胁迫的耐受性。ZmPP2AA1可能通过影响根系生长素的含量和分布调节玉米低磷耐受性生长素是一类参与调控植物多项生长发育的植物激素,且对低磷诱导的根系构型变化起重要调节作用。ZmPP2AA1过表达玉米植株轴生根顶端的生长素含量显著高于WT和ZmPP2AA1RNAi的,暗示ZmPP2AA1过表达植株轴生根卷曲且伸长受抑制可能与根中生长素水平及分布的改变相关联。此外,过表达ZmPP2AA1转基因植株对生长素运输抑制剂NPA反应更强烈,提示转ZmPP2AA1基因玉米改变了生长素运输影响玉米根尖生长素的积累,从而影响根系的生长发育及根系构型。磷缺乏环境下过表达ZmPP2AA1玉米可维持较好的茎叶生长,形成一个高度分枝的发达根系,增强对磷的吸收,其耐低磷特性显著提高。在长期低磷胁迫时,过表达ZmPP2AA1玉米植株因积累更多的磷素,生殖发育受影响较小,产量显著高于野生型玉米。ZmNF-YA1参与玉米植株生长发育和抗逆性调控培育对不利环境具有较强抗性的作物品种对于农业生产有重要意义。NF-Y转录因子在调节植物生长发育和响应逆境胁迫中发挥重要生物学功能。课题组在玉米比较转录组学研究中发现NF-Y转录因子家族成员ZmNF-YA1基因在抗旱自交系中响应干旱胁迫上调表达。本工作分析了ZmNF-YA1在玉米不同发育时期的不同器官和几种非生物逆境胁迫下的表达模式。利用ZmNF-YA1过表达和Mu转座子插入突变体为材料研究该基因对于玉米生长发育和抗逆性的影响。ZmNF-YA1在玉米植株中广谱表达,在叶片、授粉后籽粒和花药中具有较高的表达水平,暗示ZmNF-YA1可能调控这些器官的生长发育。玉米在遭受渗透胁迫、盐胁迫和热胁迫2小时后,叶片中的ZmNF-YA1的表达强度升高,且以上三种胁迫连续处理3天后,还能保持比未处理对照更高的表达量,即ZmNF-YA1应答和响应上述非生物逆境胁迫。观察溶液培养的ZmNF-YA1过表达、Mu转座子插入突变体和它们相对应的野生型自交系DH4866、W22的植株表型。在发育早期,ZmNF-YA1过表达植株的轴生根较野生型的短,而地上部分与野生型无明显差异。由于ZmNF-YA1过表达株系具有更快的生长速率,植株高度逐渐高于野生型的,地上部干重也相应增加,根系发达,侧根数目多。Mu转座子插入缺失突变体的生长发育滞后,其株高、叶片长宽及面积均显著低于野生型对照W22的,根系也不如W22的发达。这些结果表明ZmNF-YA1正向调节玉米植株茎叶及根系的生长发育。对三叶期玉米进行渗透胁迫、盐胁迫和离子毒害处理,过表达ZmNF-YA1转基因株系中干物质积累和株高受胁迫抑制的程度较野生型轻,而突变体对上述三种胁迫的响应比其对照株系更为强烈,受害程度重,表明玉米ZmNF-YA1基因表达水平的变化可影响植株对渗透胁迫、盐胁迫和离子毒害的耐受性,ZmNF-YA1参与玉米植株对逆境胁迫的响应。过表达ZmNF-YA1提高了玉米的抗旱性对五叶期植株进行干旱致死处理后再恢复正常浇水,过表达ZmNF-YA1植株大部分能恢复生长,但其野生型对照DH4866只有少数植株能恢复生长,Mu转座子插入突变体植株几乎全部死亡。过表达ZmNF-YA1可明显提高苗期玉米植株对干旱的耐受性。对开花前的盆栽植株进行干旱处理,过表达ZmNF-YA1植株生长状态好于其野生型对照,根系更为发达,叶片细胞膜受损伤程度较轻。与此相对的是过表达株系叶片积累了更多渗透调节物质,维持较高的相对含水量,具有显著升高的抗氧化保护酶活性,从而提高细胞对活性氧等自由基的清除,减少细胞损伤,维持正常功能。因此,与野生型相比,过表达ZmNF-YA1有效地提高了玉米的耐旱性。在实验室王保梅的工作中,过表达ZmNF-YB16促进玉米苗期植株生长,干旱胁迫诱导渗透调节物质增多、抗氧化酶的活性增强,过表达ZmNF-YB16植株表现出明显提高的耐旱性。这些表型与过表达ZmNF-YA1玉米植株相似。利用酵母双杂系统发现 ZmNF-YA1 可与 ZmNF-YC17 结合,ZmNF-YB16 可与 ZmNF-YC17 结合。本研究中,利用免疫共沉淀验证了 ZmNF-YA1与ZmNF-YC17在玉米体内的互作,推测ZmNF-YA1可能与ZmNF-YB16/-YC17形成复合体起转录调控作用,它们共同参与玉米的生长发育和对干旱胁迫响应的调控过程。ZmNF-YA1基因的过表达提高了玉米对干旱胁迫的抗性,为玉米品种的抗逆性改良提供了一个候选基因和可供选择的操作方案。