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干旱和盐碱是影响作物生长和造成作物减产的两个主要非生物胁迫。为了寻找水稻中与抗旱耐盐相关的基因,我们对水稻EMS诱变的突变体库进行筛选,鉴定到了一份表现抗旱耐盐性明显增强的突变体,并将之命名为dst((d)rought and(s)alt(t)olerance)突变体。通过对该突变体进行生理指标分析表明突变体的气孔开度和气孔密度都比野生型小。离子浓度测量结果显示突变体的根部和地上部积累的Na+都比野生型少。进一步分析表明由于突变体气孔的保卫细胞内积累了比野生型更多的过氧化氢(H2O2),从而导致其气孔开度变小。因此,突变体由于气孔开度和气孔密度较小,减少了水分的丧失,从而提高了其对干旱胁迫的耐受性;同时气孔开度和气孔密度的减小使得通过蒸腾作用被运到水稻地上部的Na+减少,降低了Na+对水稻植株的毒害作用,提高了突变体的耐盐性。
通过图位克隆的方法对突变的基因DST进行定位和克隆。遗传互补实验证实了所克隆到的DST基因就是控制突变体抗旱耐盐表型的基因。DST编码一个功能未知的蛋白,含有一个保守的C2H2型锌指结构域和一个核定位信号肽。在dst突变体中,DST基因发生了两个碱基突变,分别造成第69位天冬酰胺突变成天冬氨酸和第162位的丙氨酸突变成苏氨酸。组织表达模式分析表明DST基因主要在根的维管束组织、根茎结合部和叶脉以及气孔中表达。在盐旱胁迫下DST的表达量迅速下调,在胁迫处理后期则恢复到处理前的水平。亚细胞定位结果表明DST定位在细胞核内。转录激活实验结果表明DST蛋白具有转录激活活性,同时DST蛋白的N端是其发挥转录激活活性所必需,另外突变的DST蛋白完全丧失了转录激活活性。亚细胞定位和转录激活实验证明DST为一个转录因子。通过细菌单杂交实验和凝胶滞后实验,我们找到了DST结合的顺式作用元件:TGCTANNATTG,并将该新的顺式作用元件命名为DBS(DST-binding sequence)。进一步分析表明DST通过其锌指结构域与DBS进行结合,而突变的DST蛋白同样具有结合DNA的活性。
基因芯片结果表明有36个基因的表达在突变体中发生了下调,其中至少有5个基因编码的蛋白与活性氧平衡有关。这5个基因的启动子中都至少含有一个DBS。凝胶滞后实验和染色质免疫共沉淀实验分别在体外和体内证实了DST。可以直接结合这些基因的启动子,调节它们的表达。在这5个与活性氧平衡相关基因中,包含一个编码过氧化物酶的基因PRX24。过氧化物酶活性测定证实了该过氧化物酶在体外可以降解H2O2。表达分析表明PRX24与DST一样也在气孔中表达,并且在盐旱胁迫下具有与DST相同的表达模式,同时PRX24不仅在dst突变体叶片中表达下调同时在突变体气孔保卫细胞中的表达也下调。根据一系列实验,我们初步建立了DST参与调控植物抗逆的分子途径:DST可能通过直接调节过氧化氢代谢相关基因(如过氧化物酶基因)的表达,控制气孔保卫细胞内的H2O2含量,调节气孔的开度,从而影响水稻的抗旱性和耐盐性。上述的研究结果不仅为阐明作物抗旱耐盐分子遗传调控机理提出了新见解,同时也为作物抗逆分子育种提供了具有自主知识产权的重要新基因。