乳腺是哺乳动物体内最独特的器官，其发育主要发生于出生后，受与性生殖系统发育有关的类固醇和多肽类激素的调控。它的发育阶段分为胚胎期、青春前期、青春期、怀孕期、泌乳期和退乳期。在妊娠期，分泌型乳腺上皮细胞的增生和分化依赖于泌乳素受体的存在和其下游的Jak2-Stat5(Janus kinase 2-signal transducer and activator of transcription)信号通路。泌乳素或胎盘催乳素与泌乳素受体结合引起受体二聚化，使受体偶联的Jak2的特异酪氨酸残基磷酸化，进而Jak2使转录因子Stat5a和5b磷酸化。磷酸化的Stat5a和5b可形成同源和异源二聚体并进入细胞核激活下游基因引起细胞的增生和分化。Stat5a和Stat5b同属Stat家族，它们的蛋白产物有96％的相似性，在乳腺发育过程中的表达模式也非常相似，但在其羧基端的转录活化功能域有较大区别。Stat5a和Stat5b基因敲除小鼠的建立为它们的功能研究提供了动物模型。Stat5a敲除的小鼠在孕期因上皮细胞减少和分化障碍而不能形成具有正常功能的乳腺组织，然而多次妊娠后，由于Stat5b水平上调代偿了Stat5a的缺失，小鼠可以逐渐形成功能正常的乳腺。单独敲除Stat5b的小鼠表型类似于生长激素受体敲除的小鼠，这些小鼠的IGF-1(insulin-like growth factor)的水平下降，生长迟缓。然而Stat5b敲除的小鼠可以维持妊娠，分娩正常数目的新生小鼠，并正常泌乳。Stat5a／b敲除的小鼠没有正常功能的黄体从而不孕，因此不能研究正常妊娠过程中Stat5a和Stat5b对乳腺发育的影响。制备Stat5a／b条件性基因敲除(conditional gene knockout)的小鼠模型可以在不同的细胞类型和不同的发育阶段使Stat5a和Stat5b基因失活，这样才有可能了解它们在特定发育阶段的真正功能。 为了制备Stat5a／b条件性基因敲除小鼠，并全面了解Stat3／5基因座的其它基因是否参与乳腺发育和乳腺肿瘤的发生，我们首先利用Stat5a、Stat5b和Stat3的cDNA探针与小鼠BAC文库杂交，得到了两个BAC克隆，覆盖Stat5a／b基因座500kb的DNA序列，将其测序后通过BLAST(nr search)软件在NCBI数据库中搜索分布于其上的已知基因。在这500比的＊＊A序列内，J发现9个已知从山，5别为厂 ＊、a。0、＊＊5。。Statsb、Hcrt、BECZ、Gcns、Cnpl fll mDj。我们 白条什卜基l大1敲除策略为在a。6。和a。ob从回 的＊五 分别通过卜源事组号 入一对卜。xP序列，通过Cre重组酶的作用就会删除Statsa／b的牲个过国组约90kb的DNA序列。为了了解敲除Statsa儿 y国后足大会影响举问座内其它基因的表达，我们分析了这9个匕知基因在小鼠各个组织中的表达情况。在得到Statsa／b基因敲除的小鼠后，我们再分析此基因座内的各基因表达情况，以确定得到的小鼠表型是Statsa／b基因失活的结果，而不是其邻近基因表达差异引起的。 我们结合生物信息学和分子生物学方法，应用EST数据库查询。GENSCAN软件进行外显子预测及CDNA克隆的方法，发现并克隆了两个新基因，命名为DllLgpl（Lgpl，GenBank登录号为AF316996）禾DllLgpZ（LgpZ，GenBank登录号为 AF316999），它们 高度表达于乳月和乳腺肿瘤组织之中。小鼠LGni自由5肥个氨基酸残基构成，其人类的同源基因有530个氨基酸残基旧8＊问源性人LGPI 与A。bfdopsfS 4亡。入。n。的。uxlnresp。us讨eu3h饮蛋白有”％的相同序歹和打％沁’的相似性。免疫荧光分析显示 LGP在细胞内位于内质网中。小鼠和人类的 LGPZ蛋白由 678个氨基酸残基构成 94％同源性人免疫荧光分析显示LGPZ在细胞内位于细胞质中。它与人类的… 不 RNA解旋酶基因（RIG－1）有高度的同源性。 Statsde基因条件性敲除小鼠的制备是利用条什性基因敲除的方法，首先使用 Statsb 的打靶载体电转染 129SVJ 小鼠胚胎干细胞，通过Southern Blot分析筛选了 114个 G4旧 I6j｛药的胚胎于细胞克隆，得到 4个阳性的克隆，它什I的染色体核型分析均正常。随机选择一个阳。吐的胚胎于细胞克隆再应用 ＊出。的打靶载体转染此细胞克隆，选择对Hygromycin B 耐药的细胞 克隆进行 Southern BIOt分析其卜iJ源重组（homologous recomblnatlon）。共分析 65个 Hssromscin B 寸药的克隆得到19个阳性的胚胎一个细胞克隆。被们向双取m件的胚胎干细胞克隆转染pk（e载体，通过叶R检测发少了巨的等位基因，在19个胚胎十细胞克隆中共有3个克隆六个发个委纠．的PCR！”’物。选择其中的一个多能胚胎于细胞显微注射到手3．5大的小鼠案胚内，培养46小时后，将囊胚移 ．3． 植入假孕小鼠的子宫中。这些经注射的囊胚在受体小鼠内发育个分娩， 产生的后代为嵌合体小鼠。在我们的实验中共得到5只高比例的欣合鼠。 结 论 1本实验首次克隆并测序了a以巧基因座，同时对位于基因应内的9 个已知基因在小鼠不同组织的表达情况进行了分析。 2发现了两个新基因，命名为 Dll Lgp（Lgp）禾 Dll LgpZ（LgpZ?