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星状病毒(Astrovirus,Ast V)是一种感染人及猪、牛、蝙蝠、犬、猫等哺乳动物和鸡、火鸡、鸽子等鸟类的肠道疾病相关病原。鸭星状病毒属于星状病毒科禽星状病毒属,是一种单股正链、没有囊膜的RNA病毒。3周龄以内的雏鸭易感,不同于其他的禽星状病毒,鸭星状病毒可以导致鸭的致死性的病毒性肝炎,表现为肝脏出血,抽搐和角弓反张等神经症状。最近几年研究发现,鸭星状病毒和鸭甲肝病毒混合感染的情况频繁出现,使鸭病毒性肝炎的防治难度进一步增加。为了深入了解鸭星状病毒的基因组结构和功能以及致病机理等,本研究的目的是构建鸭星状病毒I型(Duck astrovirus type 1,DAst V-1)D51株cDNA DNA-lauched感染性克隆,对拯救病毒在BHK-21细胞中的增殖情况进行探究,并对D51拯救病毒在鸭子体内的分布情况利用荧光定量的方法进行了检测。1.ORF2蛋白的原核表达及抗DAstV-1血清的制备为了进行DAst V-1的IFA鉴定,本研究需要制备抗DAst V-1血清。首先将DAst V-1的衣壳蛋白基因(ORF2)分三段克隆到原核表达载体pET-32a中,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达出融合蛋白。将融合蛋白与弗氏完全佐剂混合后免疫BALB/C老鼠,分别间隔两周后,将融合蛋白与弗氏不完全佐剂混合后进行二免、三免,三免十天后采血离心后得到三份抗血清,检测发现抗血清3的P/N值最大,适于进行DAst V-1的IFA鉴定。2.DAstV-1 D51株传染性克隆的构建以及病毒的拯救在本实验室已完成的DAst V-1 D51株全基因组测序基础上,根据pABX.载体序列、核酶序列和病毒全基因组序列的酶切图谱,设计并合成四对特异性引物,将已有的11段片段通过融合PCR的方法融合成四段A、B、C、D,通过引物的形式把核酶序列分别添加在第一段的前端和第四段的末端,并在末端添加病毒基因组序列中不存在的单一酶切位点Xhol。首先将A、B片段分别连接在pEASY-T1载体上,C、D片段连接在pMD18-T载体上;然后将A、B片段通过Asc I、BamHI酶切位点连在同一个pEASY-T1载体上;最后,通过特异的酶切位点依次将AB、C、D片段依次连接在克隆载体中,组成了一个包含全长cDNA的质粒,并将其命名为pABX-DAst V。另外设计一对引物,用于突变一个碱基(6234为C突变为T)形成BglII酶切位点作为遗传标签,用于区分母本病毒和拯救病毒。将获得的pABX-DAst V质粒测序后,发现有1个碱基发生突变,而且是人为突变,氨基酸并没有发生变化。将大量提取的去毒素重组质粒pABX-DAstV转染BHK-21细胞,用灭菌PBS作阴性对照。用RT-PCR和IFA方法检测结果均为阳性。通过鉴定突变的遗传标记,表明已经成功获得了拯救病毒。3.D51毒株在细胞中增殖的探究由于没有合适的细胞系可以增殖星状病毒,因此对星状病毒的研究具有一定的局限性。由于人星状病毒可以在胰酶存在的情况下进行增殖,本研究摸索了鸭星状病毒的传代方法。将DNA-launched感染性克隆质粒转染BHK-21细胞培养72小时之后,反复冻融三次,用200μg/mL的trypsin在37℃处理1h,然后将细胞毒用胰酶抑制剂处理1h,加到长到80%汇合度细胞的细胞瓶中孵育1h,之后换上含3μg/mL trypsin的不含血清的培养基中进行培养,并可传代。4.SYBR Green I荧光定量PCR方法的建立与应用通过设计特异性引物建立了检测DAstV-1的SYBR Green I荧光定量PCR方法。建立了检测DAstV-1的标准曲线,在7.3×109~7.3×102 copies/μL范围内具有良好线性关系,标准曲线方程为Y=-3.4811x+38.429,相关系数分别为0.999,PCR循环效率分别为94.4%,检测发现该方法具有良好的重复性和特异性,灵敏度为73copies/PCR。用重组质粒转染BHK-21细胞得到的拯救病毒,接种2日龄的健康雏鸭,分别在接种后24h、36h、48h三个时间点取其心、肝、脾、肾、胸腺、法氏囊、小肠七个器官用建立的荧光定量方法进行检测。研究结果表明每个器官中都可以检测到拯救病毒,显示拯救病毒可以在鸭子体内多个不同的组织器官中增殖。