目的应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix Assisted Laser DesorptionIonization Time of Flight Mass Spectrometry,MALDI-TOF-MS)技术,选择西医病种胃癌(GC)患者、消化性溃疡(PU)患者及慢性胃炎(CG)患者,根据舌苔及病证结合分组,并与同龄正常组对照,进行唾液蛋白质组学的研究,以阐明脾虚证与肾虚证在蛋白质组水平上的唾液特异性微观特征,并应用生物信息学手段筛选证候最优化蛋白质组合并初步建立脾虚、肾虚病证结合诊断模型;并从蛋白质组水平初步探讨中医同病异证、异病同证的现代科学基础;同时,建立具有中医特色的唾液蛋白质组无创伤诊断技术,推动促进微观辨证学的发展和中医诊断学的现代化。方法采集95例唾液标本,其中正常对照者20例均为健康体检正常者,胃癌患者34例,消化性溃疡患者20例,慢性胃炎患者21例。所有疾病患者均经过胃镜和/或术后组织病理检测明确诊断。按病证结合分为以下三大组:(1)异病异证分组:即以证候为纲进行分组,全部病例按虚证辨证标准分为脾虚、肾虚、其他证候3组与正常组进行比较研究。(2)同病异证分组:将胃癌分别按虚证辨证标准分为脾虚、肾虚、其他证候3组与正常组进行比较研究。(3)西医病种分组:比较正常对照者与3种疾病及疾病之间蛋白质表达谱的差异。(4)按不同舌苔分组:比较正常薄白苔与三种病理舌苔之间蛋白质表达谱的差异。采用德国BRUKER公司的WCX磁珠及AutoflexⅢMALDI-TOF质谱仪对全部患者和正常人的唾液进行蛋白质表达谱的检测。设定所有唾液样本检测的蛋白质采集相对分子量范围为1000～10000Da。所得到的蛋白质以肽质量指纹图(PMF)的形式表示。然后使用BRUKER公司的数据分析系统(其中包括一个配套的标峰和校正峰的软件FlexAnalysis3.0和统计学分析软件ClinProTools2.1)对每个组合内的相同质荷比不同含量的蛋白进行分析比较,找到组合内蛋白含量有显著差异的质荷比峰。将组合内含量有显著差异(P＜0.05)的蛋白质波峰建立分类预测模型,选择相应条件,用统计分析软件ClinProTools 2.1对其进行分组统计,从而得到各组的特异性蛋白标志物并初步建立相应疾病、证候及病证结合的唾液蛋白质组诊断模型。用随机抽样方法(随机选择80%样本建立模型,其余的20%作为验证样本,共运行十次),验证模型的有效性(平均特异性、灵敏性及平均准确率)。用SPSS13.0软件进行各组基线值的比较,年龄的比较采用单因素方差分析,所有数据用(?)±s表达,性别构成的比较采用χ~2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。结果1、按异病异证分组:将所有患者分为脾虚、肾虚、其他证候3组加上正常组共79例样本,对所有的样本检测质谱图进行分析比较,共得到蛋白质峰为175个,其中通过遗传算法找到了10个差异显著的蛋白峰,其质荷比(m/z)分别为:7447.22Da、3963.26Da、7911.59Da、1390.85Da、6574.69Da、1167.54Da、1230.73Da、7846.3Da、2724.41Da、2223.89Da。在此基础上建立了分类预测模型,识别率为89.15%,预测能力38.63%。回代检验结果正常组19例全部被准确检出,19例脾虚患者,其中16例被准确检出,21例肾虚患者,有18例被准确检出,20例其他证候患者,有17例被准确检出。该模型的准确率为88.61%(70/79)。2、按同病异证分组:胃癌脾虚、胃癌肾虚、胃癌其他证候3组和正常组共48例,对样本检测质谱图进行分析比较,共得到蛋白质峰为161个,其中通过遗传算法找到10个差异显著的蛋白峰,质荷比(m/z):8840.72Da、3442.42Da、4120.81Da、3492.63Da、6558.43Da、5583.29Da、3286.1Da、4419.3Da、5527.57Da、3923Da。通过分析差异蛋白建立了分类预测模型,识别率为80.97%,预测能力33.47%;回代检验结果正常组19例,其中17例被准确检出,10胃癌脾虚患者全部被准确检出,11例胃癌肾虚患者,其中7例被准确检出,其他证候组8例,有6例被准确检出,该模型的准确率为83.33%(40/48)。3、按西医病种分组:①正常对照组与胃癌组两组样本共41例,对所有的样本检测质谱图进行分析比较,两个组共得到蛋白质峰为74个,其中14个统计差异显著的蛋白峰(P＜0.05),选择质荷比(m/z)为1472.78Da、2936.49Da、6556.81Da和7081.17Da这四个蛋白质峰进行建模。其中发现胃癌患者1472.78Da峰处显著高于正常人。通过对这4个蛋白峰的鉴别,建立了分类预测模型,识别率为97.83%,预测能力79.82%。临床回代检验结果,23例胃癌患者中有22例被准确检出为胃癌,18例正常组中所有18例全部被确定为非胃癌。结果表明,该诊断模型的准确率为97.56%(40/41),灵敏度为95.65%(22/23)特异度为100%(18/18)。②正常对照组与慢性胃炎组两组样本共32例,对所有的样本检测质谱图进行分析比较,两个组共得到蛋白质峰为74个,其中5个有统计差异显著的蛋白峰(P＜0.05),选择质荷比(m/z)为:5502.36Da、1441.75Da和3442.47Da这3个相关蛋白峰建立分类预测模型,识别率为91.67%,预测能力73.33%。临床回代检验结果14例慢性胃炎患者全部被准确检出,18例正常组对照者,其中15例被正确检出,该模型的准确率为90.63%(29/32),灵敏度为100%(14/14),特异度为83.33%(15/1 8)。③正常对照组与消化性溃疡组两组样本共35例,对所有的样本检测质谱图进行分析比较,两组共得到66个蛋白质峰,其中10个有统计差异显著的蛋白峰(P＜0.05),选择质荷比(m/z)为:2934.36Da、5502.38Da和3472.94Da这3个相关蛋白峰,通过分析这些差异蛋白表达谱建立了分类预测模型,识别率为88.40%,预测能力80.35%。临床回代检验结果17例消化性溃疡,其中14例被准确检出,18例正常组对照者,其中17例被正确检出,该模型的准确率为88.57%(31/35),灵敏度为82.35%(14/17),特异度为94.44%(17/18)。④慢性胃炎组与胃癌组两组样本共37例,对所有的样本检测质谱图进行分析比较,两组共得到77个蛋白质峰,其中1个有统计差异显著的蛋白峰,质荷比(m/z)为:6021.72Da。通过分析这个差异蛋白表达谱建立了分类预测模型,其识别率为83.54%,预测能力为60.23%。⑤慢性胃炎组与消化性溃疡组两组样本共29例,对所有的样本检测质谱图进行分析比较,两个组共得到蛋白质峰为79个,运用统计分析软件ClinProTools得出了最适宜的区分模式模型,该模型包括了4个相关峰,质荷比分别为:3369.79Da、3472.13Da、2900.2Da和3489.29Da,通过分析这些差异蛋白表达谱,并建立了分类预测模型,该模型的识别率92.86%,模型预测能力56.87%。⑥消化性溃疡组与胃癌组样本共42例,对所有的样本检测质谱图进行分析比较,两个组共得到蛋白质峰为77个,差异蛋白的分析建模有待进一步进行。4、按舌苔分组:正常薄白苔与三组病理舌苔(包括病理薄苔、病理厚苔和病理剥苔)共75例,对所有的样本检测质谱图进行分析比较,共得到蛋白质峰为187个,其中4个有统计差异显著的蛋白峰(P＜0.05),质荷比分别为:6447.39Da、2938.47Da、1472.34Da、145 1.77Da,通过分析这些差异蛋白峰表达谱,并建立了分类预测模型,识别率为85.31%,预测能力39.91%。对正常组19例,有18例被准确检出,56例病理组,其中40例被准确检出,该模型的准确率为85.33%(64/75)。结论:本研究利用MALDI-TOF-MS技术对健康对照组、胃癌组、消化性溃疡组和慢性胃炎组患者的唾液中的蛋白质进行表达谱的检测,从唾液蛋白质组初步筛选出了可用于临床病证结合诊断的特异生物标记物,并探索建立了相关病证结合的诊断模型。该方法与传统疾病生物标志物相关的检测方法比较,具有无创性、操作简便、快速、敏感性及特异性高等特点,其筛选出的生物标志物对于快速、准确地诊断疾病、鉴别证候、判断预后均有重要的临床意义。因此,本研究为临床疾病早期诊断和鉴别诊断开辟了新途径,并为中医微观辨证学研究开拓了全新的思路和领域。