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研究目的:椎间盘退行性疾病(degenerative disc disease,DDD)是临床上的最常见的脊柱疾患,由于疾病治疗费用的增加,对现代社会造成了严重的财政负担,目前是椎间盘退行性疾病骨科常见病。多数人在一生中有下腰痛(low back pain,LBP)的症状,椎间盘退变(intervertebral disc degeneration,IDD)是造成下腰痛的最主要原因之一。目前,椎间盘退变的确切机制仍不明朗,治疗方法仍局限于减轻症状而不是针对于解决该疾病的发病机制。随着对椎间盘退变机制的不断深入认识,最新的治疗应着重在于阻断介导椎间盘退变的生化和病理生理过程。目前得到共识的引起椎间盘退变的原因主要有:椎间盘本身的病变使椎间盘供血障碍,椎间盘局部缺血和组织坏死,导致炎症因子的产生,进而引起或加重椎间盘的退变;机械应力促进退变椎间盘释放炎症因子,椎间盘内炎症导致了椎间盘退变。所以,炎症反应及炎症因子在脊柱退行性病变中起着举足轻重的作用。引起椎间盘退变的主要炎症因子有肿瘤坏死因子-α(TNF-α),它可以通过诱导细胞凋亡,从而影响椎间盘内基质的合成代谢过程,在椎间盘退变进程中被认为是主要的调控因素。另一重要炎症因子是白细胞介素-1β(IL-1β)。IL-1β主要在感染、创伤的刺激下产生,作用与TNF-α相似,它通过诱导蛋白聚糖的降解及阻碍椎间盘内类软骨样细胞合成细胞外基质在椎间盘退变过程中起主导作用。此外,细胞培养研究也证实TNF-α能够促进IL-1βm RNA的产生。IL-1β具有增加分解代谢酶活性的作用。因此,生物治疗可以通过抑制以TNF-α与IL-1β为主的炎症因子表达从而进一步改善细胞内合成代谢过程及细胞增殖。白细胞介素-10(IL-10)能够抑制炎症因子的合成,具有很强的抑制TNF-α与IL-1β的作用。体外细胞经IL-10治疗后,90%的TNF-α被抑制,并且在IL-10表型缺陷的小鼠肠道内发生了炎症反应充分证明了IL-10抑制炎症反应的重要作用。IL-10在限制炎症因子的表达上起重要的作用。转化生长因子-β(TGF-β)促进退变椎间盘细胞内的增殖,并且通过对兔髓核细胞TGF-β进行基因治疗后,细胞内蛋白多糖的表达量增加。在关节炎模型中,转移质粒DNA编码TGF-β抑制炎症反应。而且在鼠巨噬细胞及肝星状细胞发现,而且TGF-β还能够上调IL-10合成路径促进IL-10的合成。尽管IL-10与TGF-β能够抑制炎症因子的合成,但能否用于椎间盘退变的生物治疗尚无文献报道。本课题的研究目的是通过动物实验,探索IL-10与TGF-β抑制TNF-α与IL-1β等炎症因子与介质的潜能,为临床应用提供基础依据。研究方法:本课题选1岁龄比格犬(重10-10.5kg)6只。所有比格犬均经过脊柱X线筛查以排除骨赘形成,终板钙化,许莫氏节结,腰椎椎体的数量变化等异常。矢状位MRT2加权像检查排除术前存在椎间盘退变的犬。所有比格犬经甲氧氟烷麻醉,眼睑反射消失及手术区域针刺觉消失即视为麻醉完毕。麻醉完毕后10分钟内开始手术,进行比格犬椎间盘退变造模,手术切口为后外侧L2-L5节段,16G针头穿刺L2-3、L3-4、L4-5椎间盘纤维环。所有动物均在术后6周MRT2加权像出现椎间盘信号改变。当MRI提示椎间盘信号改变,盐酸氯胺酮及盐酸赛拉嗪过量注射处死动物。无菌条件下取出L1-2、L2-3、L3-4、L4-5椎间盘髓核组织。L2-3、L3-4、L4-5髓核组织作为退变组,L1-2作为正常组。进行髓核细胞分离,髓核组织剪碎至2-3mm直径,0.2%链霉蛋白酶37°C消化60分钟,再经0.02%II型胶原酶消化过夜。加入胎牛血清培进行培养。所有检测均使用3代以内的细胞。从L1-2分离得到2×107个细胞,L2-5分离得到6×107个细胞。将退变髓核组织获得的细胞分为四组:1、未经任何治疗的退变细胞组;2、IL-10治疗组(分别于6,12,24,48h加入20 ng/ml IL-10);3、TGF-β治疗组(分别于6,12,24,48h加入20 ng/ml TGF-β);4、IL-10+TGF-β治疗组(分别于6,12,24,48h加入20 ng/ml IL-10及20 ng/ml TGF-β);正常髓核细胞组作为阴性对照。细胞经胰酶消化计数后,按2×105细胞量重悬于Ep管中,加入TNF-α单克隆抗体进Ep管,流式细胞仪进行分析平均荧光强度计算TNF-α的表达量;细胞经12h,24h,48h治疗后,分别收集每组上清液,ELASA试剂盒定量检测IL-1β与TNF-α的表达量。另外收集各组细胞,提纯出细胞总RNA:测RNA浓度,将RNA进行发转录,生成c DNA,检测Taq Man探针系统对IL-1β和TNF-α的m RNA表达进行定量分析。用stata12.0进行单因素方差分析,每组之间的两两比较采用Bonferroni方法,检测结果以X±SD表示,P<0.05有统计学差异。结果:本实验研究成功对比格犬相应的椎间盘穿刺造模,所有动物均在术后6周MRT2加权像出现椎间盘信号改变。椎间盘退变模型建立后,手术成功取出各组需要的椎间盘髓核组织。成功提取髓核细胞,细胞的形态稳定,增殖速度较快。流式细胞分析细胞内炎症因子的表达量:分别于不同时间点对四组细胞数量及平均荧光强度进行流式细胞仪检测。治疗后12h,IL-10治疗组及IL-10+TGF-β治疗组TNF-α阳性表达的细胞数较未治疗组明显降低,TNF-α的表达也明显降低(P<0.01)。治疗后24h,三个治疗组TNF-α的表达量(平均荧光强度)较未治疗组明显降低(p<0.01)。并且,IL-10+TGF-β治疗组较IL-10治疗组或TGF-β治疗组低,差异有统计学意义(p<0.01)。TGF-β治疗组与IL-10+TGF-β治疗组TNF-α阳性表达的细胞数在治疗后48h达到最低水平,TNF-α的表达量(平均荧光强度)较未治疗组明显降低(p<0.01);运用ELISA试剂盒分别于12h,24h,48h检测上清液中IL-1β和TNF-α的表达量。正常组,IL-10+TGF-β治疗组TNF-α和IL-1β的表达量明显降低。IL-1β的表达量在治疗后24h达到最低,而在48h有所增加。与未治疗组相比,IL-10+TGF-β治疗组TNF-α和IL-1β的表达量在24h和48h明显降低(p<0.01);Real-time PCR结果显示:IL-10和TGF-β治疗能抑制IL-1β和TNF-αm RNA的表达。经TGF-β治疗后,IL-1β和TNF-αm RNA的表达量从6h至24h逐渐递减。与未治疗组相比,TGF-β治疗组IL-1β和TNF-αm RNA的表达量在治疗后12h与24h明显降低(p<0.01)。与此相反,在IL-10+TGF-β治疗组或IL-10治疗组,IL-1β和TNF-α的表达量在治疗后6h迅速降低并且持续到24h。与未治疗组相比,正常组、TGF-β治疗组IL-1β和TNF-αm RNA的表达量在治疗后6h,12h,24h均明显降低(p<0.01)。结论:椎间盘穿刺造模方法能造成比格犬椎间盘退变,为生物学治疗退变椎间盘能建立良好的模型。椎间盘退变引起的炎症反应同时能够诱导上调多种炎症因子的表达。本博士课题证实应用TGF-β或IL-10能够抑制炎症因子的表达的同时,也显示二者联合应用作用较二者单独应用作用更强。IL-10与TGF-β能够稳定持续抑制TNF-α与IL-1β的产生,IL-10与TGF-β通过抑制退变椎间盘髓核细胞释放炎症介质,可能会延缓椎间盘退变的进程。另外,TGF-β与IL-10存在相似的抗炎特性,IL-10与TGF-β阻碍退变椎间盘细胞产生炎症因子的级联反应,这会限制炎症反应的进一步扩散。IL-10与TGF-β在椎间盘退变的生物治疗方面具有广阔的应用前景。