背景与目的:系统性硬化症（systemic sclerosis,SSc）是一种以皮肤、血管及内脏纤维化为特征的慢性系统性自身免疫性疾病。SSc常常影响肺血管,表现为血管壁增厚、管腔狭窄甚至闭塞,引起肺血管压力及阻力进行性升高,最后导致肺动脉高压（pulmonary arterial hypertension,PAH）。SSc-PAH目前治疗仍比较棘手,治疗效果并不理想,预后不良,治疗不及时可造成心力衰竭,甚至猝死,PAH至今仍是SSc患者死亡的主要原因之一。目前SSc-PAH发病机制尚未完全明了,涉及血管内皮损伤、平滑肌增殖重构、慢性炎症等机制,而血管平滑肌细胞增殖、血管重塑是SSc-PAH进行性发展的核心环节。早期研究认为内皮细胞间质转化是脏器纤维化中肌成纤维细胞的来源,但近年来多项研究表明,周细胞可以分化为肌成纤维细胞,是病理性纤维化中肌成纤维细胞的主要来源。周细胞本身具有舒缩功能,可以维护血管结构的完整性,调节毛细血管血流,还具有很高的可塑性,在一定条件下可以分化为软骨、骨、脂肪和纤维组织等结构。已有多项研究肝脏、肾脏及SSc纤维化的实验揭示周细胞可以分化为肌成纤维细胞,从而修复组织损伤。然而,长期的慢性炎症会导致正常的纤维化过程紊乱与失调,致使细胞外基质过度沉积及瘢痕形成,损害脏器功能。有研究显示1-磷酸鞘氨醇可与其受体结合后和血小板衍生生长因子-β相互作用,参与调控周细胞增殖、迁移和血管生成。另外,在SSc患者的外周血当中不仅存在大量活化的巨噬细胞,而且炎性细胞因子的浓度也明显高于健康对照组,这提示除周细胞外,巨噬细胞也在SSc的炎症损伤机制中发挥重要作用。巨噬细胞是一种固有免疫细胞,起源于外周组织中单核细胞的分化,活化后可形成两种经典亚型:促炎性的M1型巨噬细胞和抗炎性的M2型巨噬细胞。已有研究证实M1型巨噬细胞可诱导周细胞向肌成纤维细胞分化,从而促进损伤组织血管的修复。还有报导认为M1型巨噬细胞介导了活动性血管病变,而M2型巨噬细胞则在慢性血管病变或稳定期发挥病理作用。多项研究结果提示活化的巨噬细胞在SSc患者的血液和皮肤中特别丰富,并且认为它们可能是组织功能失调中诱导纤维化的细胞因子的潜在来源。因此,阐明巨噬细胞与周细胞在SSc-PAH中的角色以及巨噬细胞极化与周细胞之间的联系显得尤为重要。目前关于在SSc-PAH中巨噬细胞极化与周细胞的作用的基础研究较少,巨噬细胞与周细胞之间信号通路的改变也并不清楚,为此,本研究拟通过建立SSc-PAH小鼠模型,探究巨噬细胞极化与周细胞之间的联系,为临床治疗SSc-PAH提供新的线索和方向。方法:我们采用了药物（博来霉素、野百合碱）和低氧结合的方法,构建了SSc-PAH疾病模型小鼠,通过HE染色和Masson染色对小鼠背部皮肤进行观察,HE染色、EVG染色和免疫荧光染色对小鼠肺组织病理情况进行评判,并使用ELISA、流式细胞术、q-PCR方法对小鼠腹腔巨噬细胞进行鉴定;通过Western blot和免疫荧光染色对利用磁珠分选法从肺组织中提取出的周细胞进行鉴定,并通过CCK8和Western blot分别检测SSc-PAH组和正常对照组周细胞增殖能力和PDGFR-β、α-SMA的表达。将小鼠单核巨噬细胞白血病细胞株RAW264.7分为5组,经过普通完全培养基、含10 ng/m L的LPS完全培养基、含100 ng/m L的LPS完全培养基、含1000 ng/m L的LPS完全培养基、含25 ng/m L的IL-4完全培养基培养24h后,使用q-PCR方法检测各组巨噬细胞IL-1β、i NOS、TNF-α、IL-18、IL-23、IL-6、MRC1、CD163的m RMA表达;在RAW264.7经过LPS和IL-4诱导24h后,我们将培养基更换为无诱导因子的DMEM/F-12无血清培养基,48h后收集各组条件培养基,经0.22μm滤器过滤后加入到周细胞株中（周细胞原培养液∶过滤后的条件培养基=1∶1）,后用CCK8、划痕实验和小室迁移实验、血管生成实验来验证周细胞的增殖、迁移和血管生成能力,并提取经各组条件培养基培养48h后的周细胞蛋白质,通过Western blot检测周细胞中PDGFR-β、α-SMA、S1PR1、S1PR2、P16、JAK-2、P-JAK-2蛋白的表达变化;同时,我们也将人内皮细胞HUVEC与5组条件培养基共培养,48h后提取内皮细胞蛋白质,检测内皮细胞中α-SMA、S1PR1、S1PR2、P16的表达变化。用含EDTA-K2的抗凝管收集符合诊断标准的SSc-PAH病人和健康人外周血各3m L,利用人外周血淋巴细胞分离液和密度梯度离心法获得PBMC,提取PBMC中的总RNA后,经过测序比较在SSc-PAH病人PBMC中tRFs、tiRNAs以及miRNAs表达与健康人的差异。结果:1、使用博来霉素、野百合碱和低氧建立的小鼠模型中,小鼠皮肤真皮层明显增厚,胶原纤维增生明显,皮下脂肪及附属器减少和消失,肺小动脉管壁肿胀,中膜增厚,管腔狭窄,内、外弹力层均明显增厚,有炎性细胞浸润,组织损伤比较明显,肺小血管周围肌成纤维细胞和内皮细胞数量增加;2、使用博来霉素、野百合碱和低氧建立的小鼠模型中,小鼠腹腔巨噬细胞约有60.3%呈M1亚型,且肺周细胞增殖和分化能力增加;3、经不同浓度LPS诱导的M1型巨噬细胞条件培养基对周细胞增殖能力影响较小,可能是通过P16和JAK-2蛋白提高周细胞迁移、分化和血管生成能力;M2型巨噬细胞条件培养基可能是通过S1P、P16和JAK-2蛋白促进周细胞增殖、迁移、分化和血管生成;4、经过tRF、tiRNA测序和数据分析,相较于健康人,SSc-PAH病人的PBMC中有1304个tRFs和tiRNAs表达上调,1761个tRFs和tiRNAs表达下调,740个tRFs和tiRNAs表达没有明显差异;SSc-PAH病人PBMC中有459个miRNAs表达上调,374个miRNAs表达下调,236个miRNAs表达没有明显差异。结论:1、使用博来霉素、野百合碱和低氧可以成功建立小鼠SSc-PAH疾病模型,在该种模型中,小鼠体内呈早期炎症状态,腹腔巨噬细胞多数呈现M1型,肺部周细胞增殖能力和分化能力提高;2、在体外实验中,极化后的巨噬细胞可能示通过调节S1P、P16和JAK2蛋白的表达对周细胞增殖、分化、迁移和血管生成能力造成影响;3、SSc-PAH病人的PBMC中,Other-1:33-tRNA-Glu-CTC-1-M2、hsa-let-7c-5p和hsa-miR-203a-3p等tRFs、tiRNAs以及miRNAs上调或下调,可能会对该疾病发生发展产生影响。