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原发性肝癌(简称肝癌)是世界上最常见、恶性程度最高的肿瘤之一,位居全球恶性肿瘤死因第三位、我国恶性肿瘤死因第二位(世界半数以上病例发生在我国)。虽然部分肝癌病人经过早期、积极、综合治疗获得长期生存,但肿瘤转移复发已成为进一步提高其疗效的最主要障碍。肝癌根治性切除后5年复发转移率高达60％。目前临床的主要困扰在于无法早期预测哪些病人会发生转移复发,更无有效防治措施,其关键在于转移机理不清。如能探明肝癌转移的分子机理及其关键调控环节,将有助于早期识别或预测哪些病人易于转移,有助于探索有效的干预措施。
目前的TNM分期、Edmondsons分级等对肝癌临床诊断治疗起重要作用,但无法对肿瘤的转移倾向进行准确预测。以芯片技术为代表的高通量分子生物学技术的发展为在全基因组、蛋白质组范围内研究肿瘤发生、进展相关的分子改变提供了有力的手段,已在多种肿瘤的分子分型、复发转移预测、肿瘤对治疗的反应及预后等研究中得到了广泛应用。
我所前期工作中,通过比较40例伴与不伴肝内转移肝癌间、肝癌肝内转移灶与原发瘤间基因表达谱的差异,发现肝癌转移灶与其原发瘤间基因表达谱非常相似,有差异的基因数目极少(p＞0.05);而伴与不伴转移的肝癌间基因表达谱却有非常明显差异,在9180个基因中发现153个基因表达差异有显著性(p＜0.001),且这些差异与肿瘤大小、有无包膜、有无肝硬化及患者年龄等临床病理因素无关。特别是有转移小肝癌与无转移小肝癌间基因表达谱有统计学差异,说明基因表达谱的差异不是由于两组肿瘤大小等不同的因素所引起,而仅与是否伴有转移有关。据此在国际上首次提出促使肝癌转移的基因改变发生在原发肿瘤阶段的新观点(Ye QH,et al.Nat Med 2003),更新了过去认为转移潜能的获得是癌进展过程中细胞克隆筛选的结果,这对肝癌转移的防治研究战略将产生重要影响。
为了获得更纯的癌组织和进行更深入验证,本文采用激光捕获显微切割(LCM)、基因表达谱芯片和SNP芯片等技术,研究肝癌肝外转移灶与原发瘤之间以及有和无转移肝癌原发瘤之间基因变化的差异,对“促使肝癌转移基因改变发生在原发瘤阶段"的新观点进行更精确的验证,同时寻找肝癌转移的重要靶基因,为肝癌转移早期预测和干预提供可能的靶标。
第一部分 应用LCM、RNA两轮扩增和基因芯片技术研究肝癌转移潜能的起源
目的:通过LCM和RNA两轮扩增技术,对配对肝癌原发瘤及其肝外转移灶、无转移小肝癌、配对胃肠癌及其肝转移病灶以及正常肝组织基因表达谱比较研究,验证促肝癌转移基因改变始于原发瘤的新观点,寻找肝癌转移的重要靶基因。
方法:选择11例配对肝癌及其肝外转移组织标本(其中淋巴结转移5对,肾上腺转移3对,肺转移3对)、肝癌肺转移标本10例(无原发灶标本)、无转移小肝癌标本10例(直径＜5cm)、配对胃肠癌肝转移标本9对、正常肝组织5例,采用激光捕获显微切割技术切取纯肿瘤细胞进行研究。肿瘤细胞RNA抽提后通过微电泳确定RNA质量和浓度,经Affymetrix RNA两轮扩增方法,扩增后的RNA总量超过10gg。选用Affymetrix Hu133 2.0 Plus全基因表达谱芯片进行基因表达水平研究。对筛选出的肝癌转移重要靶基因进行qRT-PCR验证。
结果:通过BRBArray软件、MAS5软件等对各组基因表达谱进行分析,发现原发肿瘤和配对转移病灶之间基因表达谱相似,无统计学差异。在肺转移组与无转移组肝癌原发瘤之间有379个差异基因;在胆管细胞癌及淋巴结转移组与无转移组之间有1085个差异基因;在胃肠癌肝转移与无转移组之间有1603个差异基因。在这三组差异基因之间有12个基因重叠。选取与无转移肝癌相比在肝癌肺转移组高表达基因PGK1行qRT-PCR验证,结果显示PGK1基因在肝癌肺转移组高表达(p＜0.0002),提示PGK1基因高表达与肝癌肺转移相关。
结论:肝癌原发瘤和转移灶基因表达谱相似,而有、无转移肝癌原发瘤基因表达谱差异明显,证实促使肝癌转移的基因改变确实在原发肿瘤阶段就已经发生。PGK1基因可能成为肝癌肺转移的分子标记和干预治疗的潜在靶点。
第二部分 应用LCM和SNP芯片技术研究肝癌转移潜能的起源
目的:应用激光显微切割技术和Affymetrix SNP 6.0芯片技术对肝癌转移相关DNA拷贝数改变进行研究,进一步验证促肝癌转移基因改变始于原发瘤的新观点。
方法:选用在第一部分中芯片结果良好的53个标本(包括11对配对肝癌伴转移标本和9对配对胃肠癌伴肝转移标本),采用LCM技术收集高纯度肿瘤细胞,抽提DNA,琼脂糖电泳检测基因组DNA片段完整者,经DNA扩增后取500ng进行Affymetrix SNP 6.0芯片检测。
结果:应用Genotyping Console和Nexus分析软件对SNP芯片结果进行分析,结果发现肝癌原发瘤和转移病灶在DNA各个染色体变化上趋于一致,无明显差异。
结论:肝癌原发瘤和转移病灶DNA水平改变一致,再次说明促使肝癌转移的基因改变在原发肿瘤阶段就已经出现,为肝癌转移早期预测和干预提供了理论基础。