青蛤（Cyclina sinensis）是无脊椎动物,生活在沿海地区,是我国重要的经济贝类之一,其作为滤食性的水产生物,拥有超强的抗逆能力。贝类物种进化水平比较低,虽然没有特异的免疫细胞和相关抗体,但是它们有自己的免疫机制:有血细胞和体液免疫相互关联、相互作用,抵御外源异物的侵蚀。一些活性物质如:凝集素、抗菌肽、溶酶体酶（Lysozyme）都由血细胞或者血淋巴分泌。它们和异物的特异位点结合,发挥作用,裂解异物,一起维持本身机体环境的稳定。鲤鱼（Cyprinus carpio）是大宗淡水鱼养殖的一个重要品种,近来渔业高质量发展,除了养殖业水平提升以外,与鱼类自身免疫也有很大关系。众所周知,鱼类所生活的水环境有多种污染物质,在市场的长途运输中,也需要抵御可能出现的腐烂风险。由文献可知,鲤鱼本身产生的抑菌物质为防御素,主要在上皮组织中,如:体表、小肠等。同家族的大防御素成熟肽的N端的疏水性质保证了本身盐离子稳定性,且与细菌接触后,N末端域会驱动防御素组装成纳米网,可以捕获并杀死细菌,而成熟肽C端含有阳离子氨基酸残基,赋予了大防御素对革兰氏阴性菌的抗性功能。从之前的文献中可知,对于青蛤或者鲤鱼有些许研究,但未见其对鲤鱼防御素以及青蛤I型溶菌酶有真核表达方面的研究。同时我们知道,对贝类或者鱼类来说,其本身产生的抑菌物质的量不多,如果直接采用化学方法提取,则技术不成熟,且抑菌物质会有损失,投入的成本也很大。因此,对于I型溶菌酶以及鲤鱼β-防御素进行真核表达研究则恰到好处。首先,重组I型溶菌酶和β-防御素基因可以避免以上缺陷,且重组目的基因可以定向表达出目的溶菌酶和防御素,之后分泌出的目的蛋白不会形成包涵体,获取、纯化步骤较为简单,且技术较为成熟。本研究志在为水产品来源的天然抗菌物质提供在毕赤酵母中的重组DNA表达技术。本研究的第一阶段聚焦于青蛤I型溶菌酶基因的cDNA克隆以及重组表达载体的构建研究。通过RT-PCR获得编码青蛤I型溶菌酶的成熟肽基因,该基因的成熟肽有14个半胱氨酸残基,形成7对二硫键,氨基酸残基总数162个。设计引物,通过PCR扩增反应,在该基因成熟肽的N端添加Xho I、Kex 2;C端添加Xba I、6×His标签,最终获得目的基因“CslyI”。构建重组表达载体pPICZαA-CslyI,之后线性化,将其电转入毕赤酵母X-33中,通过高浓度的博来霉素进行筛选,以挑选出甲醇利用快速型高拷贝酵母转化子。提取阳性酵母转化子基因组,进行PCR验证。本研究第二阶段聚焦于青蛤I型溶菌酶在毕赤酵母中的重组表达以及其抑菌活性研究。将筛选得到的高拷贝酵母转化子在YPD培养基中复活,再转入BMMG培养基中积累菌体,48 h后离心、水洗,再转入BMMY培养基中,添加甲醇,在29℃、250 r/min条件下诱导表达72 h,之后离心培养液取上清。用滤膜对上清过滤除菌、再超滤浓缩至25倍,用Tricine-SDS-PAGE进行分析。之后再进行Western blot和MALDI-TOF-TOF质谱鉴定,证明其为预期的重组目的蛋白CslyI。之后在同种条件下分不同诱导时间取上清,探究对重组蛋白表达量的影响,结果显示96 h的诱导时间相对较好。之后取阳性酵母转化子发酵上清对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大肠杆菌（Escherichia coli）、副溶血性弧菌（Vibrio parahemolyticus）按照一定体积比例进行孵育,用平板菌落计数法探究重组目的蛋白的抑菌能力,结果显示,重组目的蛋白对以上三种细菌有较好的抑制作用;再将阳性酵母转化子发酵上清在不同温度下处理后,和细菌孵育一定时间,在酶标仪中检测三种细菌的细胞浓度,其结果可以反映出目的蛋白对三种细菌的抑菌性能,以研究目的蛋白的热稳定性。结果显示,经不同的温度处理后的发酵上清和未经处理后的组别其抑菌差异不显著,证明了重组目的蛋白的稳定性较好。本研究第三阶段聚焦于人工合成鲤鱼β-防御素在毕赤酵母中的重组DNA表达研究。本研究中的目的基因根据鲤鱼β-防御素登录号:JF343439.1,查找出其成熟肽基因序列号,并在成熟肽的N端、C端分别添加限制性酶切位点和信号肽识别位点,交由上海生工生物工程有限公司合成。鲤鱼β-防御素的基本信息如下:其目的基因编码的成熟肽有45个氨基酸残基,其中的6个半胱氨酸残基可以在空间上形成3对二硫键。在成熟肽基因的5’端成功添加有Xho I、Kex 2以及6×His标签,在成熟肽基因3’端有Xba I酶切位点,鲤鱼β-defensin的理论分子量为6.39 kD,pI为8.4。之后常规操作提取质粒、双酶切、和表达载体pPICZαA连接、电击转入毕赤酵母等,最后在29℃、250 r/min条件下添加1%体积比的甲醇进行诱导表达,用滤膜对发酵上清进行除菌、使用膜包进行浓缩,同样用Tricine-SDS-PAGE和Western blot分析鉴定表达产物,证明其为预期的重组目的蛋白β-defensin。本研究成功地在毕赤酵母中表达了重组青蛤I型溶菌酶和鲤鱼β-防御素,并通过一些设计证明青蛤I型溶菌酶有生物学活性。本研究为贝类以及鱼类来源天然抗菌剂的制备提供了基于重组毕赤酵母的生物合成技术途径。