肾细胞癌(renal cell carcinoma, RCC)起源于肾实质肾小管上皮细胞,其发病率高,大约90%的肾脏恶性肿瘤为RCC。随着人们生活方式和生活环境的改变,肾癌的发病率不断增加。据世界癌症中心资料显示,2015年美国预测新发的肾癌患者人数为61,560,肿瘤特异性死亡患者数目也高达14,080。我国肾癌的患病人数也逐年增加,少于膀胱癌成为泌尿男生殖系第二位肿瘤。对于晚期转移性RCC患者来说,免疫治疗和靶向药物治疗已成为各大指南推荐的治疗策略。尤其随着分子遗传学的发展,越来越多的分子信号通路被发现在RCC中行使着重要的功能。在此基础上,美国、欧洲以及中国批准了越来越多的靶向药物用于治疗晚期转移性RCC。然而,随着分子靶向药物的应用,靶向药物的耐药性问题严重影响了RCC治疗的疗效。因此寻找RCC发生发生进展中新的靶点以及信号通路,预测RCC患者的预后,指导靶向药物的选择以及寻求靶向药物耐药后的解决方案已成为晚期转移性RCC研究中亟待解决的问题。Cullins进化上高度同源,参与构成了最大的E3泛素连接酶,参与调控细胞周期、转录、信号转导和发育等重要的生物进程。人类基因编码8种Cullin成员,包括CUL1、CUL2、CUL3、CUL4A、CUL4B、CUL5、CUL7和PARC。CUL4B在细胞增值、DNA复制及细胞周期调控等方面行使相应功能。X染色体上CUL4B发生突变可以造成精神发育迟滞。敲除CUL4B的小鼠在胚胎阶段发生死亡。除此以外,CUL4B具有定位于细胞核的信号,在细胞核里面行使相关功能。研究证实CUL4B能够抑制miR-372和miR-373,上调CDK2的表达,从而促进DNA的复制。此外,CUL4B能够下调抑癌基因p16、PTEN等的功能,促进肿瘤的发生。因此,最近一段时间许多研究都发现了CUL4B在恶性肿瘤中行使相应的功能。研究发现CUL4B与肝癌、结直肠癌、胶质瘤、骨肉瘤以及肿瘤微环境等密切相关。但是,CUL4B在泌尿系统的肿瘤尤其是RCC中的作用及机制尚未有文献报道。c-Met是酪氨酸激酶受体(receptor tyrosine kinase, RTK),与其特异性配体肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)相结合后,发生同源二聚化和磷酸化,从而发挥相应的作用。c-Met与HGF结合后激活一系列通路,包括Ras/Raf/MEK/ERK通路、PI3K/Akt通路以及黏着斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)通路等。HGF/MET是调控血管生成、细胞增殖、细胞周期以及细胞侵袭转移等的重要信号通路。尽管c-Met在正常生理条件下对于维持组织稳态非常重要,但是c-Met突变、扩增以及过表达等变化,造成其在人类肿瘤中异常激活。研究发现c-Met在肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma, ccRCC)和乳头状肾细胞癌(papillary renal cell carcinoma, pRCC)中均过表达。c-Met的表达水平与RCC的病理特性以及疾病的预后转归关系密切。因此c-Met抑制剂如卡博替尼等作为RCC治疗中的靶向药物也纷纷进入临床试验阶段。近期研究表明c-Met激活与恶性肿瘤分子靶向药物治疗中的耐药问题关系密切。因此,c-Met在RCC发生发展及靶向药物耐药等方面具有重要研究价值,但是CUL4B对c-Met通路是否有调控作用,目前尚未有文献报道。基于以上研究背景,我展开了下面的研究：首先,探讨CUL4B在RCC中的表达及作用；然后,寻找CUL4B在RCC中的作用机制,通过蛋白芯片发现c-Met可能在CUL4B的调控中发挥重要作用；最后进一步探讨CUL4B调控c-Met通路对RCC的影响。通过本课题的研究以期发现RCC发生进展中新的靶点和分子信号通路,从而更好地预测RCC患者的预后、指导靶向药物的选择以及寻求靶向药物耐药后的解决方案。第一部分CUL4B在肾细胞癌中的表达及作用已知CUL4B在多种肿瘤中发挥重要作用,且表达量都升高,为进一步探讨CUL4B在RCC中是否同样具有促进肿瘤发生进展的作用,本部分利用了人肾细胞癌细胞系、人肾癌组织标本以及裸鼠成瘤动物模型等实验对象,展开相应研究。具体情况如下：1.CUL4B在RCC细胞系以及RCC组织中表达升高：细胞培养RCC细胞系769-P、786-0和OS-RC-2以及正常的永生化的肾小管上皮细胞系HK-2,运用western blot的方法测定CUL4B在以上细胞系中的表达水平,发现CUL4B在3种RCC细胞系中的表达水平明显均高于HK-2中的表达水平。收集33例肾脏肿瘤术后,病理已证实的RCC标本,同时收集肿瘤旁边正常肾脏组织,同样运用western blot的方法检测CUL4B在33对RCC组织和正常肾皮质中蛋白表达水平的差异,发现CUL4B在其中27对(81.8%)组织中,肿瘤比瘤旁表达含量高。2. CUL4B的表达水平与RCC的分级、分期以及预后等呈正相关关系：应用RCC的组织芯片,芯片中包含90例RCC患者的基本病理信息以及随访数据。采用免疫组织化学(IHC)染色的技术,对CUL4B的表达水平进行检测。反应RCC中CUL4B表达的总得分为组织染色强度评分乘以组织染色阳性率得分。得分>6分评为高表达,反之为低表达。分别统计CUL4B高表达和低表达的人数,运用卡法检验计算CUL4B的表达水平与患者年龄、性别、核分级、病理分期以及肿瘤大小的关系。发现CUL4B的表达水平与年龄无关(P=0.278),与性别无关(P=0.876),与肿瘤核分级呈正相关(P=0.006),与病理分期呈正相关(P=0.02),与肿瘤大小无关(P=0.054)。随后,运用Kaplan-Meier生存分析,对统计数据进行对数秩检验,发现CUL4B高表达患者肿瘤特异性生存率降低(P=0.031)。3. CUL4B表达水平的变化影响RCC细胞系增殖、克隆形成、侵袭及迁移等生物学行为：运用慢病毒感染的方法成功构建CUL4B干扰或过表达的RCC细胞系模型(shControl、shCUL4B、PLOC、PLOC-CUL4B)。应用Western blot测定CUL4B干扰或过表达的RCC细胞已构建成功。采用MTT来检测细胞增殖情况,发现CUL4B干扰的RCC细胞系(shCUL4B)较对照组(shControl)相比,细胞增殖速率明显降低(P<0.05)；与次相反,CUL4B过表达的细胞系(PLOC-CUL4B)与对照组(PLOC)相比,细胞增殖速率显著增加(P<0.01)。采用克隆形成方法检测细胞克隆形成能力,发现shCUL4B细胞较shControl组相比,14天后细胞克隆形成率明显降低(P<0.01)；与次相反,PLOC-CUL4B细胞与PLOC组相比,克隆形成率明显增加(P<0.001)。运用划痕实验检测细胞迁徙能力,24小时后进行观察,发现shCUL4B细胞较shControl组相比,细胞迁徙速率明显降低(P<0.05)；与次相反,PLOC-CUL4B细胞与PLOC组相比,细胞迁徙速率明显增加(P<0.05)。运用Transwel实验检测细胞侵袭能力,发现shCUL4B细胞较shControl组相比,细胞侵袭速率明显降低(P<0.05)；与次相反,PLOC-CUL4B细胞与PLOC组相比,细胞侵袭速率明显增加(P<0.01)。4. CUL4B表达水平的变化影响RCC细胞系在裸鼠中的成瘤能力。为了进一步明确CUL4B具有促进RCC生长的作用,应用CUL4B干扰的RCC细胞和BALB-c雄性小鼠进行裸鼠成瘤实验。8周后明确裸鼠中肿瘤的大小,进行统计学分析,发现干扰掉CUL4B的RCC细胞系较对照组相比,成瘤体积明显减少(P<0.001)。综合第一部分的研究内容：CUL4B在RCC中表达明显增加,并且CUL4B的表达水平与RCC的分级分期密切相关,CUL4B表达水平的增加造成RCC较差的核分级与病理分期。CUL4B表达水平的增加与RCC患者预后较差也关系密切。进一步细胞水平的研究也证实,CUL4B的表达水平与RCC细胞的增殖、克隆形成、侵袭迁移以及成瘤能力密切相关。第二部分CUL4B调控c-Met通路对肾细胞癌的影响通过第一部分的研究,发现CUL4B在RCC中行使重要功能,但是其详细的分子机制,目前研究尚不透彻。为进一步探讨CUL4B在RCC中的作用机制,展开了第二部分的研究。1.干扰CUL4B的RCC细胞中c-Met磷酸化水平降低。由于RTK的激活在RCC发生进展中行使重要功能,因此目前治疗转移性RCC的靶向药物大部分是酪氨酸激酶抑制剂(Inhibitor of tyrosine kinase, TKI)。鉴于以上情况,采用RTK磷酸化水平蛋白芯片,检测干扰掉CUL4B的RCC细胞中RTK的磷酸化水平。发现干扰掉CUL4B的RCC细胞较对照组相比,c-Met、PDGFR-αTNK1、Tie-1及PDGFR-β等RTK的磷酸化水平都有不同程度的降低；其中c-Met磷酸化水平下降80%,下降程度最明显。2. c-Met在RCC中表达上调且与CUL4B表达水平正相关。(1)从33对RCC标本中取出10对CUL4B高表达的标本,采用western blot的方法检测c-Met蛋白表达水平。发现在10对标本中,c-Met在肿瘤中的蛋白水平与正常组织相比,显著性升高,与CUL4B表达水平相一致。(2)应用western blot的方法检测c-Met在3种RCC细胞769-P、 786-O、 OS-RC-2以及HK-2中的表达情况。发现c-Met在3种RCC细胞系中的表达水平均明显高于HK-2中的表达水平,与CUL4B变化相一致。(3)应用RCC组织芯片,采用IHC方法检测c-Met的蛋白表达水平。发现c-Met的表达水平与年龄无关(P=0.688),与性别无关(P=0.398),与肿瘤核分级呈正相关(P=0.008),与病理分期呈正相关(P=0.002),与肿瘤大小无关(P=0.002)。随后,运用Kaplan-Meier生存分析,对统计数据进行对数秩检验,发现c-Met高表达患者肿瘤特异性生存率降低(P<0.001)。对CUL4B与c-Met的表达水平进行相关性分析,发现CUL4B与c-Met的表达水平呈正相关(P=0.02)。3. CUL4B正向调控c-Met通路。运用干扰掉CUL4B或过表达CUL4B的RCC细胞模型(shControl、shCUL4B、PLOC、PLOC-CUL4B)。采用Western blot对c-Met通路上的关键分子表达水平进行检测。发现干扰掉CUL4B的细胞系较对照细胞相比,c-Met、c-Met磷酸化水平、AKT磷酸化水平均明显降低。与此相反,CUL4B过表达的细胞系较对照细胞相比,c-Met、c-Met磷酸化水平、AKT磷酸化水平均明显升高。运用实时定量RT-PCR的方法测定4种细胞模型中c-Met的mRNA表达水平,有趣的是,发现c-Met在4种细胞中的mRNA水平无显著性改变。为进一步验证我们的结论,我们应用CUL4B基因敲除小鼠,应用Western blot方法测定CUL4B敲除小鼠肾脏中c-Met蛋白表达水平,发现敲除CUL4B的小鼠肾脏中c-Met表达水平也显著降低。4. CUL4B通过上调c-Met促进RCC细胞增殖、克隆形成及侵袭转移。采用CUL4B过表达的RCC细胞,加入c-Met抑制剂SU11274,检测RCC细胞增殖、克隆形成及侵袭转移能力。RCC细胞的增殖状态通过MTT的方法进行检测,发现加入c-Met抑制剂SU11274的CUL4B过表达RCC细胞较未处理的CUL4B过表达RCC细胞相比,细胞增殖速率明显降低(P<0.01)。采用克隆形成方法检测细胞克隆形成能力,发现加入c-Met抑制剂SU11274的CUL4B过表达RCC细胞较未处理的CUL4B过表达RCC细胞相比,14天后细胞克隆形成率明显降低(P<0.001)。RCC细胞的侵袭状态通过Transwe的方法进行检测,发现加入c-Met抑制剂SU11274的CUL4B过表达RCC细胞较未处理的CUL4B过表达RCC细胞相比,细胞侵袭速率明显降低(P<0.001)。5. CUL4B通过上调c-Met诱导RCC细胞对一线TKI产生耐药,应用c-Met抑制剂后可逆转RCC细胞的耐药性。(1)运用干扰掉CUL4B或过表达CUL4B的RCC细胞模型(shControl、 shCUL4B、PLOC、PLOC-CUL4B),加入一线TKI舒尼替尼(Sunitinib),应用MTT方法检测肾癌细胞在不同时间点对不同浓度Sunitinib的反应。用10μM和20μM的Sunitinib作用48h后,发现干扰掉CUL4B的RCC细胞较对照细胞相比,细胞活性明显降低(P<0.01)；与此相反,CUL4B过表达的RCC细胞较对照细胞相比,细胞活性显著增强(P<0.01和P<0.001)。用20μM的Sunitinib分别处理细胞24h、48h和72h后,发现干扰掉CUL4B的RCC细胞较对照细胞相比,细胞活性明显降低(P<0.05,P<0.01和P<0.001)；与此相反,CUL4B过表达的RCC细胞较对照细胞相比,细胞活性显著增强(P<0.05、P<0.01和P<0.01)。(2)将c-Met抑制剂SU11274预先加入干扰掉CUL4B或过表达CUL4B的RCC细胞模型(shControl、shCUL4B、PLOC、PLOC-CUL4B)中,然后加入Sunitinib,应用MTT方法检测肾癌细胞在不同时间点对不同浓度Sunitinib的反应。发现干扰掉CUL4B或过表达CUL4B的RCC细胞对Sunitinib的反应无显著性差异。综合第二部分内容,发现CUL4B通过调控c-Met通路对RCC的增殖、侵袭转移及预后发挥着重要作用。此外,CUL4B通过激活c-Met通路促进RCC对一线靶向药物产生耐药性,c-Met通路的阻断可逆转这一耐药性。