背景及目的肝癌是世界上六大恶性肿瘤之一,具有发病率高、死亡率高等基本特征,其早期低诊断率和晚期治疗及预后引起的其他病变和感染是导致肝癌患者死亡的主要原因。手术、放疗及化疗是目前肝癌治疗最有效的传统治疗手段,但这些传统方法都存在一系列严重的副作用。随着现代分子生物学的发展,基因治疗作为近年发展的治疗手段,在肝癌的诊断、治疗及预后中具有无可比拟的优势,而肿瘤相关基因功能的研究又是诊断、治疗的关键所在。RNAi技术的出现为肿瘤基因功能的研究带来了新方法,也为进一步研究肿瘤的发病机制提供了更高效的研究手段,同时为肿瘤的基因治疗提供新思路。膜联蛋白A2(ANXA2)属于细胞恶性转化相关基因,其异常表达与肿瘤细胞的转移、浸润、粘附及癌症的发生发展和转移密切相关,大量资料显示其在肝癌细胞中表达量有所升高,同时也可作为血清标志物对肝癌进行诊断。本课题拟通过RNA干扰技术,下调ANXA2在人肝癌SMMC-7721细胞内表达,进一步研究ANXA2表达对肝癌细胞运动相关蛋白的表达与分布的调控,以及ANXA2下调后细胞内与运动相关的显微结构的变化,深入探讨以ANXA2作为靶基因进行肿瘤基因治疗的可能性,为肝癌的基因治疗提供和积累最新的实验资料与证据。因此,不断探索肝细胞癌恶性转化进程中相关基因的重要作用,进一步深入理解和探究肝癌的发展与恶性转化机制,有助于当前肝癌诊断和治疗瓶颈的突破。方法1.优化磷酸钙法转染条件,采用优化的磷酸钙转染法将靶向ANXA2的干扰重组质粒导入SMMC-7721细胞。2.扫描电镜观察分析细胞表面形态及运动结构。3.透射电镜观察分析细胞内部亚显微结构。4.直接免疫荧光和间接免疫荧光法标记细胞骨架的不同结构,激光共聚焦显微镜观察分析F-actin、β-tubulin表达与分布变化。5.免疫细胞化学法和细胞凋亡检测法分别检测LaminB的表达和分布变化及细胞核的形态变化。结果1.优化磷酸钙转染条件,确定最佳转染组合,60%～70%细胞汇合率,转染前1h换入转染培养基,8μg/皿质粒用量,20-25min质粒复合物形成时间,10h孵育时间。2.扫描电镜结果显示：下调ANXA2表达后,细胞表面的微绒毛结构减少,伪足等运动结构受损,其变化呈时间依赖性。3.透射电镜结果显示：下调ANXA2表达后,细胞器等微结构形态及分布变化明显,染色质固缩等。4.免疫荧光染色结果显示：下调ANXA2表达后,部分F-actin分布呈无序状,其表达减弱,微丝骨架受损,细胞间接触抑制现象有一定的恢复；P-tubulin分布组织性变差,同时出现一定的解聚现象。5.免疫细胞化学及细胞凋亡检测结果显示：下调ANXA2表达后,LaminB的表达水平降低,其光密度值也有不同程度的降低,并呈现一定的时间依赖性；细胞核形态有一定的变化,并呈现程度不同的凋亡特征。结论通过RNAi可有效抑制SMMC-7721细胞内ANXA2的表达。SMMC-7721细胞内ANXA2表达在细胞骨架重塑、细胞微结构及细胞恶性表型变化等过程中具有重要调控作用。因此,ANXA2未来有望成为肝癌治疗的靶基因,在肝癌的基因治疗中发挥作用。本课题的研究为肝癌的治疗提供了新的思路和方法,并为肝癌的基因治疗提供前期实验资料及证据。