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巴斯德毕赤酵母表达系统是分子学领域内被广泛应用于重组蛋白生产的主要系统之一，既具有操作简单，生长快等特点，又具有真核细胞的翻译后修饰加工系统。在外源蛋白表达系统中，影响蛋白表达的一个主要因素是启动子活性。启动子作为基因表达的重要调控元件，通过与转录因子相互作用控制基因转录的起始和表达水平，在转录水平上起重要作用，因而启动子活性的高低在很大程度上影响着蛋白的表达水平。在毕赤酵母表达系统中，醇氧化酶基因的启动子PAOX1是最常用的启动子，已实现了各种外源蛋白的高效表达尤其是人源蛋白的表达。但PAOX1是甲醇诱导型启动子，在食品、医药上的应用受到限制，且甲醇的储存和运输等存在火灾隐患，因此毕赤酵母非甲醇诱导的启动子在不断被开发。根据本实验室对毕赤酵母转录组的研究数据，在以甘油为碳源的培养基中，转录水平最高的是被命名为GCW14（NCBI编号：XM002490678）的细胞壁蛋白基因，该基因为组成型表达，推断GCW14具有潜在的高活性启动子。此外，根据已有的实验数据证明：敲除毕赤酵母基因组上的GCW14基因会降低以Gcw14p为锚定蛋白的CALB的表面展示酶活力，说明壁蛋白Gcw14p与外源蛋白表面展示的效果有关。本研究将壁蛋白Gcw14p的启动子PGCW14应用于南极假丝酵母脂肪酶B（CALB）的毕赤酵母表达中，并与启动子PAOX1、PGAP、PTEF1的活性进行比较；对PGCW14启动子进行突变，初步探索该启动子的作用元件；将活性提高的突变启动子应用于CALB的表达中，提高CALB的酶活力，也为提高毕赤酵母外源蛋白的表达奠定基础。主要研究内容如下：（1）为了比较PGCW14和其他3种启动子PAOX1、PGAP、PTEF1表达CALB的能力，构建了4种不同启动子的CALB表面展示重组菌：X33/pPG14-CALB、X33/pZαA-CALB、X33/pPGAP-CALB和X33/pPTEF1-CALB。同时，为了比较α-信号肽和Gcw14p自身信号肽GCW14-SP的活力，还构建了Gcw14p自身信号肽的载体X33/pPSPGCW14-CALB。实验结果表明：从各重组菌的最高菌体酶活力来看，PGCW14的活力与PAOX1接近，且高于PGAP、PTEF1；从相同时间各重组菌得到的总酶活力来看，PGCW14具有更高的产酶效率，是PAOX1产酶效率的4倍左右，分别是PGAP、PTEF1产酶效率的2倍；使用Gcw14p自身的信号肽要优于α信号肽，菌体酶活力提高约4%。（2）采用在线分析软件TESS对启动子PGCW14进行作用元件的预测，根据预测结果对可能存在的两个TATA box和一个CAAT box进行了定点突变，结果表明位于-48位的TATAAA序列启动子是TATA box的可能性较大。再通过启动子截短、随机突变和高通量筛选，结合TESS预测结果，对启动子的作用元件进行了初步探索，确定了存在作用元件的区域及几个可能的顺式作用元件。（3）在启动子的突变实验中，发现启动子序列的第+20位的核苷酸由dGTP突变为dATP时，启动子活力有所提高，将其应用于CALB的表达中，使CALB的分泌表达酶活力增加了约34%，CALB的表面展示酶活力增加了约33%。