论文部分内容阅读
微丝骨架作为真核细胞中动态变化的三维网状结构,在植物感知和抵抗病原菌侵染中发挥重要作用。微丝骨架参与植物的免疫反应,但其如何参与免疫信号传导过程,目前所知甚少。小麦条锈病是由条形柄锈菌(Puccinia striiformis f.sp.tritici)引起的小麦生产上危害严重的一种真菌病害,但是小麦抗条锈病机制研究尚不完全清楚。因此,从模式植物拟南芥以及小麦重要病害条锈病入手,研究微丝骨架actin(肌动蛋白)介导的植物免疫机制,对全面了解微丝骨架参与拟南芥免疫机制,以及进一步阐明小麦与条锈菌互作的分子机理,具有重要意义。本研究以拟南芥和小麦作为研究对象,主要通过微丝骨架荧光标记、酵母双杂交、免疫共沉淀、蛋白磷酸化、病毒诱导基因沉默、LC/MS(liquid chromatography/mass spectrometry,液相色谱/质谱)技术和MAPK(mitogen-activated protein kinase,丝裂原活化蛋白激酶)等实验技术和方法,筛选与微丝骨架肌动蛋白ACT7互作蛋白,对拟南芥微丝骨架肌动蛋白ACT7、肌动蛋白结合蛋白CAP1和小麦肌动蛋白解聚因子ADF4的功能进行了深入研究。主要研究结果如下:1.对拟南芥cDNA文库进行筛选,选出24个与ACT7互作的蛋白,其中包括actin结合蛋白ADF1、ADF4和ARPC3等,与植物免疫相关的RIN4、ROC4、LOS2蛋白,以及CAP1等多个目前在植物免疫中功能尚不清楚的蛋白。利用酵母双杂交和免疫共沉淀技术,进一步验证了ACT7与RIN4、CAP1的蛋白相互作用。2.利用拟南芥-丁香假单胞菌模式互作系统,发现ACT7和CAP1参与DC3000和DC3000AvrRpm1引起的拟南芥免疫反应,ACT7负调控拟南芥抗病性,CAP1正调控拟南芥抗病性。与野生型Col-0相比,act7-2突变体抑制DC3000繁殖,相反cap1突变体促进DC3000大量繁殖。cap1突变体产生严重坏死斑,act7-2突变体几乎无坏死斑产生。与野生型Col-0相比,act7-2突变体抑制DC3000AvrRpm1生长,坏死面积降低,表现更为抗病;cap1突变体促进DC3000AvrRpm1生长,抑制HR反应,坏死面积增加,表现更为感病。3.利用flg22诱导的MAPK实验,证明突变CAP1显著抑制flg22诱导的MAPK3/MAPK6的积累,而突变ACT7促进flg22诱导的MAPK3/MAPK6的积累。与对照相比,flg22处理后10 min,cap1突变体中MAPK3/MAPK6积累量显著降低;act7-2中MAPK3/MAPK6积累量升高。qRT-PCR检测发现,PTI信号途径marker基因FRK1在act7-2突变体中显著上调表达;在cap1突变体中显著抑制表达。表明ACT7和CAP1参与flg22诱导的MAPK信号级联反应PTI途径。4.采用Phos-tag技术对DC3000AvrRpm1诱导RIN4在act7-2和cap1突变体中磷酸化情况进行分析,发现与野生型相比,ACT7突变后,RIN4磷酸化被促进并增强,而RIN4磷酸化在CAP1突变后受到抑制。接种病原菌DC3000AvrRpm1后,act7-2中RIN4积累量显著降低,而cap1中RIN4的积累却未降低。qRT-PCR分析显示,ETI免疫相关基因RPM1、PR1以及WRKY70在ACT7突变后表达量升高,在CAP1突变后表达量显著降低。表明ACT7和CAP1参与RIN4介导的拟南芥ETI免疫信号途径。5.从小麦cDNA文库中,克隆了6个小麦ADF基因,分别命名为TaADF3、TaADF4、TaADF5、TaADF6、TaADF8和TaADF11。酵母双杂交及免疫共沉淀结果,证明TaADF4与TaACT1、AtADF4与AtACT7直接互作,同时TaADF4与AtACT7、AtADF4与TaACT1交叉互作。蛋白三维结构建模,TaADF4与AtADF4蛋白模型几乎完全重合,表明TaADF4和AtADF4结构功能相似。小麦ADFs与TaACT1特异性互作分析显示,TaADF8不与TaACT1互作,且TaADF8蛋白结构模型独立于另外5个小麦ADF蛋白结构模型,表明不同的小麦ADFs可能存在功能特异性。激光共聚焦显微观察,发现TaADF4-RFP与TaACT1-GFP荧光标记蛋白信号共定位于微丝骨架。蛋白磷酸化实验,证明AtADF4和TaADF4活性被CPK3磷酸化调节。6.qRT-PCR分析显示,TaADF4参与小麦生物与非生物应答,TaADF4被高温、茉莉酸甲酯和脱落酸诱导上调表达,盐和低温显著抑制其表达。TaADF4在小麦与条锈菌CYR23非亲和互作中表达量显著高于小麦与条锈菌CYR31亲和互作。利用VIGS技术沉默TaADF4后,小麦对条锈菌CYR23的抗性降低。LatB处理微丝骨架诱导TaADF4上调表达,抑制条锈菌菌丝生长,促进活性氧的积累和过敏性坏死。利用LC/MS技术,对植物激素JA(jasmonic acid茉莉酸)和SA(salicylic acid水杨酸)的积累进行检测,结果显示TaADF4沉默后,JA的积累量较对照组明显降低。以上结果证明,TaADF4通过参与小麦JA信号途径转导,积极调节小麦对条锈菌小种CYR23的抗性作用。综上所述,本研究进一步解析了微丝骨架在植物免疫过程中的重要作用,首次发现并证明了微丝骨架肌动蛋白ACT7和环化酶相关蛋白CAP1,参与flg22诱导的MAPK拟南PTI信号途径和RIN4介导的ETI信号传导途径,最后探索了小麦肌动蛋白解聚因子TaADF4在小麦抵抗条锈病侵染过程中的作用,为全面了解植物的病害分子机制提供了理论依据。