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研究背景肽基脯氨酰顺/反异构酶NIMA互作蛋白1(peptidyl-prolyl cis/trans isomerases,NIMA-interacting1,PIN1)是目前发现的人体内唯一能特异性识别蛋白质中磷酸化的丝氨酸/苏氨酸-脯氨酸(p Ser/Thr-Pro)的顺反异构酶。其通过催化底物的顺反异构,对细胞的增殖、存活及凋亡等产生重要影响。PIN1的表达受到严格的调控,其表达失调在许多病理状态下发挥着重要的作用,尤其是癌症及神经系统损伤性疾病,如阿尔兹海默症及缺血性脑卒中等。成体神经干细胞(Neural Stem Cells,NSCs)具有自我更新能力、多向分化潜能和迁移能力,当神经系统受到损伤,如神经退行性疾病、缺血缺氧损伤时,NSCs可以增殖、迁移、分化为新生神经细胞,以代偿结构和功能损伤。PIN1在神经系统中高度表达,但是PIN1基因在成体NSCs中的作用却未见报道。现有的PIN1基因全身性敲除小鼠会导致小鼠出现脏器异常、早衰及不育等异常症状,故需建立条件敲除的小鼠品系及PIN1基因敲除的成体神经干细胞系来进行PIN1基因在成体NSCs中的功能研究。PIN1在体内成体NSCs中的条件敲除我们会使用Nestin-Cre ERT2;PIN1F/F小鼠在2月龄注射他莫昔芬来获得。而在体外培养的成体NSCs中建立PIN1基因敲除系,首先必须得到高质量的成体NSCs,目前NSCs的体外培养有一定难度,不易大量获得,且增殖率较低,随着体外培养代次的增加,NSCs更易出现贴壁分化现象。因此需要优化NSCs体外培养条件,提高NSCs的体外分离、培养的存活率及寿命,维持NSCs的干性。且针对体外培养的成体NSCs靶向基因编辑鲜有报道,为此优化并利用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立PIN1基因敲除的NSCs系,不仅可为NSCs的精确基因编辑提供新的思路,也为研究PIN1基因在NSCs中的作用打下基础。研究目的通过优化成体NSCs体外培养条件,以延长体外培养的NSCs的寿命及存活率,维持NSCs干性。并利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除成体NSCs的PIN1基因,建立PIN1基因敲除的神经干细胞系,对其自我更新、增殖和分化能力等进行分析。检测体内成体NSCs的增殖、分化水平,鉴定得到了Nestin-Cre ERT2;PIN1F/+小鼠,为进一步研究PIN1基因在成体NSCs中的功能奠定基础。研究方法1.取8周龄C57BL/6小鼠,提取侧脑室脑室下区(Subventricular Zone,SVZ)的NSCs,通过优化的体外培养条件进行体外培养,利用免疫荧光(Immunofluorescence,IF)对NSCs的特异性表达蛋白Nestin、增殖能力和多向分化潜能进行检测。2.利用荧光定量PCR检测NSCs及小鼠各组织中PIN1基因的表达水平,利用IF检测PIN1在体外培养NSCs中的表达。3.利用在线工具(https://zlab.bio/guide-design-resources)设计并合成靶向小鼠PIN1基因的单链向导RNA(Single guide RNA,sg RNA),以PX330质粒为骨架,构建PIN1的Cas9打靶载体,转染小鼠的成体NSCs,通过Puromycin筛选和测序鉴定获得PIN1基因敲除的单克隆细胞;利用western blot、IF测定PIN1蛋白表达水平,IF分析PIN1基因敲除NSCs自我更新、增殖和分化能力。4.利用免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)和IF检测PIN1在成年小鼠SVZ和海马齿状回颗粒下层(Subgranular Zone,SGZ)中的表达分布,最终通过配繁杂交获得Nestin-Cre ERT2;PIN1F/F小鼠。实验结果在成年小鼠SVZ区存在NSCs,通过Brd U标记及Ki67染色,显示SVZ区NSCs处于增殖状态。采用优化后的NSCs体外培养条件,IF结果显示体外培养多个代次NSCs的Nestin阳性比例均达到90%以上,Brd U标记实验结果显示体外培养24h的原代NSCs Brd U阳性率为71.8%。NSCs诱导分化后,对星形胶质细胞的特异性标志物GFAP、神经元的特异性标志物TUJ-1及少突胶质细胞的特异性标志物OLIG 2进行免疫荧光检测,均有阳性表达,可见体外培养的NSCs经多次传代后仍具有增殖、多向分化的干细胞特性。IHC及IF结果显示PIN1在体内、体外培养的NSCs中高度表达。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功构建了PIN1基因敲除的NSCs,并获得9个单细胞克隆,Western blot和IF检测结果显示PIN1基因敲除的NSCs中无PIN1蛋白的表达。IF结果显示体外培养的成体NSCs PIN1基因敲除后增殖能力有所提高,且在不影响星形胶质细胞和少突胶质细胞生成的情况下,显著抑制了神经元的分化。目前已获得Nestin-Cre ERT2;PIN1F/+小鼠,为后续研究PIN1基因在成体NSCs中的功能打下基础。结论本研究通过优化NSCs的体外培养条件,延长了体外培养的NSCs的寿命及存活率,并保持较强的自我更新能力。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功获得PIN1基因敲除的神经干细胞系,证明该技术为NSCs的精确基因编辑提供了一种快速、灵活且高效的工具。体外培养的成体NSCs PIN1基因敲除后增殖能力有所提高,且在不影响星形胶质细胞和少突胶质细胞生成的情况下,显著抑制了神经元的分化。通过配繁目前已获得Nestin-Cre ERT2;PIN1F/+小鼠,为后期进一步研究PIN1基因在成体NSCs中的功能打下基础。