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利用基因敲除技术我们对几种蛋白磷酸酶在白色念珠菌细胞形态发生和细胞周期检验点调控中的功能,进行了系统研究,获得一系列有意义的研究结果。 Glc7及调节因子Shpl的功能。Glc7的表达缺失会导致G2/M期的阻滞。而且GLC7/glc7△单缺失突变体也会对遗传胁迫呈现高的敏感性。Glc7的调节因子Shp1参与调节细胞形态、细胞周期和DNA损伤应答过程。SHP1敲除会引起细胞生长速率减慢而且细胞呈现短棒状的形态。通过流式细胞术我们发现shp1△细胞出现延迟的G2/M期。Mad2是纺锤体检验点蛋白,我们在mad2△细胞中再敲除SHP1,shp1△细胞出现延迟的G2/M期的表型可以回补,mad2△shp1△双敲除细胞呈现正常的细胞周期,这说明SHP1缺失导致的细胞周期异常是由于纺锤体检验点的激活所造成的。同时在血清诱导和包埋情况下,SHP1敲除会引起较短的菌丝生长。而且shp1△细胞对热激和遗传胁迫更为敏感。深入的研究发现Shp1参与调节Glc7的细胞核积累,这说明Shp1可能通过调节Glc7的细胞核定位,来发挥它的生物学功能。 PPT1基因的功能。Ppt1属于蛋白磷酸酶PP5,它在白色念珠菌中也参与DNA损伤应答过程。通过流式细胞术,我们发现PPT1基因的敲除并不影响细胞对DNA损伤的应答。但是在ppt1△菌株中,一个重要的参与DNA损伤的蛋白Rfa2的磷酸化形式有明显的积累,这显示Ppt1可能参与Rfa2去磷酸。由于在ppt1△菌株中Rfa2高磷酸形式的积累,造成DNA损伤检验点的异常,从而导致ppt1△菌株对DNA损伤更高的敏感性。 Ptc2的功能研究。白色念珠菌中Ptc2参与细胞生长,以及包埋情况下的菌丝生长。PTC2基因缺失对遗传毒性药物MMS、HU和4-NQO都有更高的敏感性,而ptc2Apph3A菌株对遗传毒性的敏感性比ptc2△菌株和pph3△菌株的敏感性更高,这显示Ptc2和Pph3在DNA损伤过程中分别具有不同的功能。细胞形态和细胞周期的结果表明,ptc2A菌株和ptc2△pph3△菌株在MMS处理后的释放过程中无法恢复到酵母形态生长以及正常的细胞周期。这说明Ptc2参与了DNA损伤胁迫后的恢复过程。