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研究背景与目的神经母细胞瘤是小儿最常见的恶性实体肿瘤,是一种胚胎发育性肿瘤。Wnt/β-catenin信号通路是调控胚胎发育的关键途径之一,参与调控细胞的分化、增殖、极性及迁移。近年来的研究发现肿瘤中普遍存在Wnt/β-catenin信号通路重要调节因子β-catenin的激活,因而深入β-catenin与神经母细胞瘤的关系,从胚胎发育异常的角度解释神经母细胞瘤发生的可能原因,寻找其治疗上有用的靶基因,为神经母细胞瘤的防治提供新的思路。因此,本实验的研究目的是检测人神经母细胞瘤细胞株中β-catenin的表达,并构建相应特异的RNAi表达载体,从转录后水平抑制β-catenin基因表达,为研究Wnt/β-catenin信号通路提供技术工具；同时利用构建稳定抑制β-catenin基因表达的人神经母细胞瘤细胞株,通过体内外肿瘤增殖实验,初步探讨β-catenin对神经母细胞瘤增殖的影响及可能机制,为神经母细胞瘤靶向治疗寻找新的靶点提供科学理论依据。材料与方法一、人神经母细胞瘤细胞株β-catenin基因特异性shRNA表达载体的选择及shRNA载体的设计和构建：1.使用PCR和Western-blot方法检测人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y、BE2C中β-catenin在基因和蛋白水平的表达情况。2.对SH-SY5Y、BE2C细胞分别进行质粒脂质体转染、慢病毒侵染效率评价,选择合适shRNA表达载体及相应细胞株。3.设计合成针对β-catenin mRNA不同位点的4条shRNA编码序列,连接到慢病毒载体质粒中,并设立阴性对照组及空白对照组,侵染细胞后利用Realtime-PCR和Western Blot外源性筛选最有效干扰序列。二、稳定抑制β-catenin的人神经母细胞瘤细胞株的建立及鉴定：筛选出的1条shRNA编码序列的慢病毒表达载体再次侵染细胞,使用嘌呤霉素筛选并扩大培养后获得稳定细胞克隆株,以Realtime-PCR、Westemblot检测β-catenin基因、蛋白表达的变化,验证抑制效果。三、β-catenin沉默表达对人神经母细胞瘤细胞增殖生长的影响：1.利用有效的RNAi慢病毒抑制人神经母细胞瘤细胞β-catenin表达,CCk-8法检测抑制β-catenin后对肿瘤细胞增殖的影响。2.将稳定抑制β-catenin表达的肿瘤细胞接种裸鼠,建立裸鼠皮下移植瘤动物模型,并设立阴性对照组及空白对照组,比较成瘤率、成瘤时间、肿瘤生长曲线、瘤重等指标,评估RNA干扰抑制β-catenin基因表达的体内实验效果。四、统计方法：结果应用SPSS18.0统计软件进行分析,数据以x±S表示,组间差异用单因素方差分析,P<0.05时差异具有统计学意义。结果一、人神经母细胞瘤细胞株β-catenin基因特异性shRNA表达载体的选择及shRNA载体的设计和构建：1.PCR和Western-blot检测显示人神经母细胞瘤细胞株BE2C中的β-catenin在mRNA转录水平以及蛋白水平均有较好的表达。2. SH-SY5Y、BE2C细胞质粒脂质体转染效率均极低,细胞BE2C较SH-SY5Y慢病毒侵染效率高,且后续培养稳定。3.成功构建针对β-catenin基因4个不同位点的RNAi慢病毒表达载体质粒,并筛选出G1为最有效干扰序列。二、稳定抑制β-catenin的人神经母细胞瘤细胞株的建立及鉴定：1.成功筛选并建立了稳定抑制β-catenin的人神经母细胞瘤BE2C细胞株。2. Realtime-PCR和Western Blot验证RNAi慢病毒稳定转染的BE2C细胞,可以高效、稳定的抑制β-catenin基因的表达。三、β-catenin沉默表达对人神经母细胞瘤细胞增殖生长的影响：1.稳定抑制β-catenin基因表达可抑制人神经细胞瘤BE2C细胞的增殖。2.抑制β-catenin基因表达可抑制BE2C细胞裸鼠皮下移植瘤的生长。结论1.β-catenin在人神经母细胞瘤细胞株BE2C中呈阳性表达,提示β-catenin异常可能与神经母细胞瘤有关。2.稳定抑制β-catenin表达的人神经母细胞瘤细胞株BE2C的建立,可以作为研究Wnt/β-catenin信号通路的重要技术手段。3.稳定阻断β-catenin基因表达可以抑制人神经母细胞瘤细胞株BE2C的增殖,并影响裸鼠皮下移植瘤的形成及生长,提示β-catenin可能是影响神经母细胞瘤增殖的重要调节因子。