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乙肝病毒是一种嗜肝DNA病毒，依赖于血液、母婴和性传播，长期感染乙肝病毒会导致慢性乙肝、肝硬化、肝衰竭、肝细胞癌等。据世界卫生组织统计，全球约有2.57亿人乙肝患者，占世界人口约4％，而我国是乙肝高流行区，乙肝携带者有约9千万。目前，HBV临床治疗药物主要包括人体免疫调节剂干扰素类和病毒DNA聚合酶抑制剂核苷（酸）类似物，然而这两种类别的药物都不能完全治愈乙肝。且干扰素耐受性差、抗病毒效果中等、发生毒副反应风险高以及需要皮下注射;而核苷（酸）类似物停药后易反弹、易产生耐药性、需要终生服药、存在未知的长期毒性和治疗费用较为高昂等。因此，新型HBV抑制剂的研究迫在眉睫。
目前处于临床和临床前研究的HBV抑制剂靶向HBV生命周期的关键环节，其中衣壳（核心）蛋白抑制剂由于其靶标的多功能性而备受瞩目。在众多衣壳蛋白抑制剂中，二氢嘧啶类衣壳蛋白抑制剂GLS4目前处于临床Ⅱ期，细胞水平的抗病毒活性好，但是其在体内易代谢、生物利用度低且水溶性小，在临床中主要与利托纳韦（HIV蛋白酶抑制剂）联合使用，这一定程度上限制了GLS4的临床应用。
因此，本论文第二章针对GLS4在体内易代谢的缺点，利用氘代药物的同位素动力学效应，将其易代谢位点二氢嘧啶母环6位吗啉环替换为氘代吗啉，设计合成了GLS4的氘代药物GLS4D。希望可以维持GLS4的抗病毒效应的同时，改善其代谢性质。活性测试结果显示，氘代药物GLS4D在Hep38.tet.7细胞系中表现出对HBV DNA复制的强烈抑制效果(EC50=0.038±0.004μM)，细胞水平的抗乙肝病毒活性略微优于先导化合物GLS4(EC50=0.082±0.018μM)，且细胞毒作用较低（CC50＞1μM）。进而对于GLS4D的代谢性质进行了研究。考察GLS4D与人肝微粒体共同培养下其稳定性，GLS4D的肝固有清除率为232.1mL/min/kg，而GLS4的文献报道值为20mL/min/kg，GLS4D在肝微粒体中的代谢速率约为GLS4的十倍。为了探究氘代药物GLS4D的代谢速率加快的原因，对GLS4D进行了细胞色素(CYP)450酶亚型的抑制实验，发现GLS4D是多种CYP450酶的代谢底物，包括2C9、2C19、2D6和3A4。最后，对GLS4D进行了大鼠体内的药代动力学研究，发现GLS4D的吸收更低、分布更广、清除率更快、生物利用度更低。总的来说，氘代策略没有对GLS4的快速代谢得到改善，需要对GLS4的代谢机制进行更深入的研究。
本论文第三章针对GLS4易代谢、水溶性差的缺点，在保留GLS4优势骨架的基础上，利用骨架跃迁的药物化学策略，在二氢嘧啶母环6位引入螺环结构。螺环结构由于其比较刚性而立体的三维结构，可以改变药物分子的水溶性、脂溶性和ADME性质及毒性，并且可以改善活性、降低毒性、提高半衰期以及突破现有专利设计全新骨架的小分子药物。因此，将螺环的片段应用于6位溶剂开口区处，共设计合成了29个杂芳基二氢嘧啶类（Heteroaryldihydropyrimidines，HAP）-螺环化合物，其中化合物4r活性最好(EC50=0.2μM)，优于阳性药物3TC，约为GLS4活性的1/4，细胞毒性低（CC50＞87.03μM）。且4r的cLogP预测值为4.5，优于GLS4(cLogP=4.747)。
蛋白降解靶向嵌合体（PROteolysis TArgeting Chimeria，PROTAC）技术由于其多重优势而在多种靶标的应用中绽放光彩。GLS4的抗病毒机制为诱导HBV衣壳蛋白的错误组装，而PROTAC可以直接靶向降解蛋白，如果对HBV衣壳蛋白使用PROTAC策略，是否可以靶向降解病毒衣壳，以及利用病毒蛋白的多功能性发挥出抗病毒更大的潜力？为了解决这种困惑，本论文的第四章利用GLS4骨架，对HBV衣壳蛋白使用PROTAC策略，测试其EC50和CC50，并对其机制初步考察。在对靶蛋白结构、结合口袋特征和肝细胞的组织特异性进行分析后，共设计合成了15个GLS4-PROTAC类似物，包括三个系列:不含E3连接酶配体（A系列）、Linker连接GLS4和E3连接酶配体（B系列）和甲基化封闭E3连接酶配体（C系列），A和C系列作为阴性对照。所有GLS4-PROTAC类似物均在20μM和5μM浓度水平活性初筛中表现出强烈的抑制HBV DNA复制能力;复筛结果显示，所有GLS4-PROTAC类似物的EC50值均处于低微摩尔水平，三个化合物的活性接近阳性药物3TC，约是GLS4活性的十分之一，Ⅱ-8c(EC50=0.48±0.08μM)、Ⅱ-8i(EC50=0.46±0.06μM)和Ⅱ-8j(EC50=0.43±0.05μM)。三个系列的活性A系列低于B、C系列;毒性A系列比B、C系列更大。这说明，向GLS4-Linker引入E3连接酶配体会提高化合物的细胞活性，降低化合物的细胞毒性，这初步验证了GLS4-PROTAC的设计合理性。通过HBV衣壳蛋白和核心蛋白的免疫印迹实验，检测了GLS4-PROTAC类似物对HBV衣壳组装和核心蛋白表达的影响:衣壳印迹试验结果表明，GLS4的衣壳相较于对照组相比差别不大，这与GLS4在低浓度下诱导衣壳错误组装的机制相符;而GLS4-PROTAC所有化合物除了Ⅱ-7b之外，都显著降低了衣壳的量。这可以说明GLS4-PROTAC类似物的抗病毒机制与GLS4不同，GLS4在低浓度下诱导衣壳错误组装，而GLS4-PROTAC类似物使衣壳明显减少。对核心蛋白表达进行相似的检测，从定量结果来看，在细胞中存在的核心蛋白数量与形成的衣壳数量之间有着非常好的一致性。从化合物的影响来看，与GLS4相比，GLS4-PROTAC类似物显著降低了核心蛋白总量，多个化合物直接使核心蛋白的信号强度降低至10％以下，这说明GLS4-PROTAC类似物正在引起核心蛋白降解。总的来说，GLS4-PROTAC化合物表现出较好的细胞活性和较低的细胞毒性，并且其抗病毒机制得到了初步验证，GLS4-PROTAC类似物通过降低核心蛋白积累和减少衣壳形成从而发挥抗病毒效应。
目前处于临床和临床前研究的HBV抑制剂靶向HBV生命周期的关键环节，其中衣壳（核心）蛋白抑制剂由于其靶标的多功能性而备受瞩目。在众多衣壳蛋白抑制剂中，二氢嘧啶类衣壳蛋白抑制剂GLS4目前处于临床Ⅱ期，细胞水平的抗病毒活性好，但是其在体内易代谢、生物利用度低且水溶性小，在临床中主要与利托纳韦（HIV蛋白酶抑制剂）联合使用，这一定程度上限制了GLS4的临床应用。
因此，本论文第二章针对GLS4在体内易代谢的缺点，利用氘代药物的同位素动力学效应，将其易代谢位点二氢嘧啶母环6位吗啉环替换为氘代吗啉，设计合成了GLS4的氘代药物GLS4D。希望可以维持GLS4的抗病毒效应的同时，改善其代谢性质。活性测试结果显示，氘代药物GLS4D在Hep38.tet.7细胞系中表现出对HBV DNA复制的强烈抑制效果(EC50=0.038±0.004μM)，细胞水平的抗乙肝病毒活性略微优于先导化合物GLS4(EC50=0.082±0.018μM)，且细胞毒作用较低（CC50＞1μM）。进而对于GLS4D的代谢性质进行了研究。考察GLS4D与人肝微粒体共同培养下其稳定性，GLS4D的肝固有清除率为232.1mL/min/kg，而GLS4的文献报道值为20mL/min/kg，GLS4D在肝微粒体中的代谢速率约为GLS4的十倍。为了探究氘代药物GLS4D的代谢速率加快的原因，对GLS4D进行了细胞色素(CYP)450酶亚型的抑制实验，发现GLS4D是多种CYP450酶的代谢底物，包括2C9、2C19、2D6和3A4。最后，对GLS4D进行了大鼠体内的药代动力学研究，发现GLS4D的吸收更低、分布更广、清除率更快、生物利用度更低。总的来说，氘代策略没有对GLS4的快速代谢得到改善，需要对GLS4的代谢机制进行更深入的研究。
本论文第三章针对GLS4易代谢、水溶性差的缺点，在保留GLS4优势骨架的基础上，利用骨架跃迁的药物化学策略，在二氢嘧啶母环6位引入螺环结构。螺环结构由于其比较刚性而立体的三维结构，可以改变药物分子的水溶性、脂溶性和ADME性质及毒性，并且可以改善活性、降低毒性、提高半衰期以及突破现有专利设计全新骨架的小分子药物。因此，将螺环的片段应用于6位溶剂开口区处，共设计合成了29个杂芳基二氢嘧啶类（Heteroaryldihydropyrimidines，HAP）-螺环化合物，其中化合物4r活性最好(EC50=0.2μM)，优于阳性药物3TC，约为GLS4活性的1/4，细胞毒性低（CC50＞87.03μM）。且4r的cLogP预测值为4.5，优于GLS4(cLogP=4.747)。
蛋白降解靶向嵌合体（PROteolysis TArgeting Chimeria，PROTAC）技术由于其多重优势而在多种靶标的应用中绽放光彩。GLS4的抗病毒机制为诱导HBV衣壳蛋白的错误组装，而PROTAC可以直接靶向降解蛋白，如果对HBV衣壳蛋白使用PROTAC策略，是否可以靶向降解病毒衣壳，以及利用病毒蛋白的多功能性发挥出抗病毒更大的潜力？为了解决这种困惑，本论文的第四章利用GLS4骨架，对HBV衣壳蛋白使用PROTAC策略，测试其EC50和CC50，并对其机制初步考察。在对靶蛋白结构、结合口袋特征和肝细胞的组织特异性进行分析后，共设计合成了15个GLS4-PROTAC类似物，包括三个系列:不含E3连接酶配体（A系列）、Linker连接GLS4和E3连接酶配体（B系列）和甲基化封闭E3连接酶配体（C系列），A和C系列作为阴性对照。所有GLS4-PROTAC类似物均在20μM和5μM浓度水平活性初筛中表现出强烈的抑制HBV DNA复制能力;复筛结果显示，所有GLS4-PROTAC类似物的EC50值均处于低微摩尔水平，三个化合物的活性接近阳性药物3TC，约是GLS4活性的十分之一，Ⅱ-8c(EC50=0.48±0.08μM)、Ⅱ-8i(EC50=0.46±0.06μM)和Ⅱ-8j(EC50=0.43±0.05μM)。三个系列的活性A系列低于B、C系列;毒性A系列比B、C系列更大。这说明，向GLS4-Linker引入E3连接酶配体会提高化合物的细胞活性，降低化合物的细胞毒性，这初步验证了GLS4-PROTAC的设计合理性。通过HBV衣壳蛋白和核心蛋白的免疫印迹实验，检测了GLS4-PROTAC类似物对HBV衣壳组装和核心蛋白表达的影响:衣壳印迹试验结果表明，GLS4的衣壳相较于对照组相比差别不大，这与GLS4在低浓度下诱导衣壳错误组装的机制相符;而GLS4-PROTAC所有化合物除了Ⅱ-7b之外，都显著降低了衣壳的量。这可以说明GLS4-PROTAC类似物的抗病毒机制与GLS4不同，GLS4在低浓度下诱导衣壳错误组装，而GLS4-PROTAC类似物使衣壳明显减少。对核心蛋白表达进行相似的检测，从定量结果来看，在细胞中存在的核心蛋白数量与形成的衣壳数量之间有着非常好的一致性。从化合物的影响来看，与GLS4相比，GLS4-PROTAC类似物显著降低了核心蛋白总量，多个化合物直接使核心蛋白的信号强度降低至10％以下，这说明GLS4-PROTAC类似物正在引起核心蛋白降解。总的来说，GLS4-PROTAC化合物表现出较好的细胞活性和较低的细胞毒性，并且其抗病毒机制得到了初步验证，GLS4-PROTAC类似物通过降低核心蛋白积累和减少衣壳形成从而发挥抗病毒效应。