胃癌是消化道最常见的恶性肿瘤之一,每年全世界大约有100多万新发胃癌患者,在国内某些地区已居全部恶性肿瘤死亡原因之首。近年来,随着胃癌相关研究的不断深入,人们在胃癌的发病机制和临床诊治方面取得了大量的成果,但目前,胃癌的诊治仍面临许多困难,整体治疗效果仍不理想,其临床特点依然表现为三低一高,即早期诊断率低(约10%),手术切除率低(<70%),5年生存率低(约40%),根治术后复发转移率高(约50%)。因此,积极寻找新的胃癌防治手段,进一步提高胃癌的总体防治水平,在我国将具有积极而重要的现实意义。survivin是近年发现的细胞凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein,IAP)家族的一个新成员,对细胞凋亡和细胞分裂周期有双重调控作用:Survivin直接作用于caspase,主要抑制凋亡终末效应器caspase-3和caspase-7的活性或干扰caspase-9的活性,阻断由各种刺激诱导的细胞凋亡的共同通路;survivin特异性的在细胞周期G2/M期表达,通过与细胞有丝分裂纺锤体的微管结合,参与对细胞基因的转录调控。由于survivin选择性的组织细胞分布特征以及抑制细胞凋亡特殊的作用机理,可能成为肿瘤诊断的标志物以及肿瘤基因治疗的新靶点。针对凋亡抑制基因survivin靶向治疗可以促进肿瘤细胞凋亡并抑制其增殖,而对正常组织几乎没有影响。本课题将利用siRNA技术抑制survivin基因的表达,为胃癌的基因治疗提供一个新的可能的靶点及相关理论依据。目的:利用RNA干扰(RNAi)技术,以survivin为靶基因,设计构建siRNA真核表达载体,进行测序鉴定,并检测该表达载体转染胃癌细胞系SGC-7901后survivin基因表达情况和对胃癌细胞生物学行为的影响,为进一步研究survivin基因在胃癌发生发展中的作用以及介导肿瘤细胞生物学行为变化的效果、为胃癌的基因治疗提供新的技术方案和理论依据。方法:1.设计具有短发夹结构的DNA序列,经退火成互补双链,再克隆至载体pEGFP-C1中构建重组质粒,转化DH5α菌株,经菌落PCR鉴定后,提取质粒行酶切鉴定,并进行序列测定。2.利用构建成功的siRNA表达质粒,通过脂质体介导转染胃癌细胞株SGC-7901细胞,并通过免疫荧光染色、RT-PCR检测细胞中survivin mRNA的表达。3.通过脂质体介导将survivin siRNA转染SGC-7901细胞;综合运用MTT法、流式细胞仪分析、DNA凝胶电泳分析、TUNEL染色等方法,检测survivin siRNA作用于SGC-7901细胞后,细胞周期﹑DNA碎片及细胞凋亡的改变。结果:1.所构建载体pEGFP-C1-s1、2、3经PCR、限制性酶切鉴定和基因测序证实为survivin siRNA的真核表达载体;2.利用成功构建的三种siRNA表达质粒,通过脂质体介导,转染SGC-7901细胞,RT-PCR、免疫荧光法检测结果显示survivin siRNA真核表达载体高效而特异地沉默了SGC-7901细胞survivin基因的表达,但针对不同部位序列的siRNA真核表达载体抑制效率不同,以pEGFP-C1-s1的抑制效果最佳;3.克隆形成实验显示,经survivin siRNA作用后SGC-7901细胞克隆形成率呈逐渐降低的趋势。细胞增殖活性结果显示:转染后survivin siRNA处理后SGC-7901细胞增殖活性有一定程度的降低,与未经处理的对照组细胞及转染空载体的细胞相比差异显著(P<0.05)。4.转染survivin siRNA后,转染细胞出现形态学改变。流式细胞仪检测发现,转染survivin siRNA的SGC-7901细胞周期发生改变,转染后G1期细胞显著增加,出现G1期阻滞现象;流式细胞仪检测、TUNEL染色结果显示转染survivin siRNA的SGC-7901细胞与亲本细胞、转染空载体细胞相比,细胞凋亡率显著增加(P <0.05);同时,DNA凝胶电泳出现凋亡特有的“DNA ladder”。结论:1.成功构建survivin基因siRNA表达质粒pEGFP-C1-s1、2、3。2. suvivin基因siRNA的真核表达载体能够在SGC-7901中成功发挥特异、有效的基因沉默作用。可明显降低胃癌细胞survivin基因mRNA的表达。3.重组质粒pEGFP-C1-s1、2、3均可降低survivin基因mRNA的表达,但pEGFP-C1-s1较后两者作用更明显。4.通过转染survivin siRNA于SGC-7901细胞可以将细胞阻滞于G1期,诱导SGC-7901细胞产生凋亡。说明survivin基因对于维持正常的细胞周期和抑制肿瘤细胞的凋亡发挥着重要作用。