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单细胞凝胶电泳(single cell gel electrosis,SCGE),又称彗星实验(comet assay),是一种在单细胞水平进行DNA损伤的检测方法,具有简便、灵敏、快捷、样品用量小等优点,广泛用于遗传毒性检测、环境毒性检测、分子流行病学和DNA损伤与修复等研究领域。 我们在本实验室建立了单细胞凝胶电泳技术,并对部分操作流程进行了改良,包括(1)制胶方法改良;(2)增加水洗;(3)进行梯度酒精脱水。在上述改良过程中,我们用“灌胶”法在载玻片上制胶,替代了传统的使用磨砂载玻片上“三明治”制胶,解决了彗星实验中常见的脱胶现象,脱水后有利于获得平整胶面;在裂解后增加了水洗步骤,以消除裂解液中的高盐和去垢剂对后续实验操作的影响;采用直流稳压电源进行单细胞电泳,保证了实验结果的可重复性;对染色的条件进行了筛选,确定了使用EB作为细胞DNA的荧光染料;以CASP(免费)作为彗星图像的分析软件,建立了图像分析的方法。这些实验步骤的改良以及实验流程的优化或标准化,简化了操作程序,节省了时间,并使结果分析更加简便。 为了验证上述改良后的实验系统是否可靠,我们用紫外线作为损伤因子处理细胞,诱导细胞DNA损伤,然后用彗星实验检测这一损伤。从这一阳性模型的结果分析来看,发现细胞损伤呈现出很好的时间依赖性,表明该实验系统的可靠性。我们同时筛选并评价了彗星实验中有关的DNA损伤分析指标,发现Tail Length,Comet Length,Tail Moment和Olive Tail Moment作为DNA损伤的评价指标比较可靠。 我们建立了肝细胞的组织块原代培养系统。在建立肝细胞组织块原代培养实验流程中,我们对实验的各个步骤,例如组织块贴壁需要的时间、细胞生长所需的培养基种类、培养基添加剂以及动物组织供体年龄等进行了筛选,建立了小鼠肝细胞组织块的原代培养系统。 我们用单细胞凝胶电泳方法对磁场和抗癌药物对人白血病细胞K562以及小鼠原代肝细胞的DNA损伤进行了检测。结果发现,K562细胞在9mT稳恒磁场中处理12h即可引起细胞的DNA损伤,这一损伤随处理时间的延长而增加,具有时间依赖效应;同样条件下对原代肝细胞的处理以及更长时间的处理(36h、48h、72h)均未发现细胞的DNA损伤。在使用较低浓度紫杉醇(50ng/mL)处理K562细胞12h后,即可导致细胞DNA损伤,并表现出时间依赖效应,而仅在高浓度长时间的紫杉醇(800ng/mL,24h)处理下才会引起肝细胞的DNA损伤。800gg/mL环磷酰胺处理K562细胞12h即可引起细胞的DNA损伤,而在1200gg/mL时方才引起肝细胞的DNA损伤。