糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是引起糖尿病患者终末期肾病和过早死亡的主要原因,近年来,研究者们发现炎症通路在糖尿病肾病的发展发挥核心作用。在糖尿病肾病的动物实验和临床研究中,各种促炎症分子,包括肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor alpha,TNF-α)、白介素-18(Interleukin-18,IL-18)、细胞间黏附分子-1(Intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)以及髓样分化因子88(Myeloid differentiation factor 88,MYD88)均被发现异常增高。而这些促炎症分子的转录受到了核因子-kappa B的调节(Nuclear factor-kappa B,NF-κB),并促进了糖尿病肾损害的进展,包括细胞外基质的改变、纤维化、肾小球硬化症等。经过近十年来的研究,越来越多的证据表明micro RNA(mi RNA)在参与了糖尿病肾病的发生发展。在我们之前的研究中,我们发现上调mi R-451抑制早期糖尿病肾病系膜增殖。而最近的研究证据表明,mi R-451特异表达于人类疾病,并对炎症反应具有关键作用。然而,在糖尿病肾病中mi R-451和NF-κB激活的相互关系尚不清楚。当NF-κB抑制蛋白α(IκBα)被免疫蛋白酶体降解时,可以释放活化的NF-κB转录因子,并从细胞质中转入到细胞核内。大型多功能蛋白酶7(Large multifunctional protease 7,LMP7)是免疫蛋白酶体的催化核心之一。有研究发现,LMP7促进NF-κB转录因子的活化从而促进炎症反应。因此,我们推测,LMP7的高表达可能通过影响NF-κB转录因子的活性从而影响糖尿病肾病的发生发展。在我们早期的肺癌研究中发现,LMP7是mi R-451的靶基因。我们推测在糖尿病肾病中是否mi R-451可以靶向调控LMP7,但是这个问题还没有被研究证实。因此,我们用以下的实验展示,在糖尿病肾病中,mi R-451通过靶向调控LMP7抑制NF-κB介导的促炎症分子表达,从而缓解糖尿病肾病对肾小球的伤害。第一部分mi R-451在糖尿病肾病中的表达及靶基因验证目的检测高糖培养的小鼠肾小球系膜细胞及db/db小鼠肾皮质中mi R-451的表达,初步探讨mi R-451与糖尿病肾病的关系;预测并验证mi R-451对小鼠肾小球系膜细胞中LMP7的靶向调节作用。方法通过实时荧光定量PCR检测中mi R-451相对表达水平;用生物信息学方法,预测并筛选mi R-451的靶基因LMP7,并通过实时荧光定量PCR和western blot检测糖尿病肾病db/db小鼠肾皮质中以及高糖和低糖条件下培养的小鼠肾小球系膜细胞LMP7内源性表达变化;用实时荧光定量PCR检测转染mi R-451 mimics和inhibitor后mi R-451和LMP7 m RNA的相对表达水平;western blot检测LMP7蛋白的相对表达水平;构建靶基因结合位点的野生型和突变型LMP7表达质粒,将这些质粒和mi R-451 mimics或者mimics NC共转染293T细胞,用双荧光素酶报告基因验证mi R-451和LMP7 3’UTR靶向关系。结果mi R-451在糖尿病肾病小鼠肾脏和高糖培养的小鼠系膜细胞中相对表达水平明显下降(p<0.05);LMP7在糖尿病肾病小鼠和高糖培养的小鼠系膜细胞中相对表达水平明显增高(p<0.05);转染mi R-451mimics和inhibitor可以有效的上调和抑制mi R-451相对表达水平(p<0.05);经过预测、q RT-PCR、western blot和双荧光素酶报告基因实验显示mi R-451可以与靶基因LMP7 3’UTR靶向结合,并且mi R-451显著调节LMP7的m RNA和蛋白相对表达水平(p<0.05)。结论mi R-451相对表达水平的异常下降和小鼠糖尿病肾病密切相关;mi R-451通过与靶基因LMP7 3’UTR结合调节LMP7的表达。第二部分mi R-451通过调节LMP7/NF-κB信号通路影响小鼠系膜细胞促炎症因子的表达目的探讨调节mi R-451的表达对LMP7/NF-κB信号途径激活的调控及NF-κB转录因子下游的促炎症因子转录影响;了解mi R-451对肾纤维化的影响。方法通过western blot检测小鼠系膜细胞在高糖条件下转染mi R-451 mimics对NF-κB转录因子关键蛋白p-IκB、IκB和p65相对表达水平的影响;通过western blot检测小鼠系膜细胞在低糖条件下转染mi R-451 inhibitor对NF-κB转录因子关键蛋白p-IκB、IκB和p65相对表达水平的影响;细胞免疫荧光化学定位小鼠系膜细胞中转染mi R-451mimics和inhibitor对p65进入细胞核情况的影响;western blot检测PR-957抑制LMP7的活性后调节mi R-451的表达对NF-κB转录因子关键蛋白相对表达水平的影响;通过实时荧光定量PCR和Ch IP检测调节mi R-451的表达对NF-κB转录因子与下游的促炎症因子基因TNF-α、IL-18、MYD88和ICAM-1启动子的结合以及转录的影响;通过实时荧光定量PCR检测调节mi R-451的表达对促纤维化因子TGF-β1、FN、collagen I和collagen IV转录m RNA的影响。结果western blot结果显示,mi R-451 mimics可以抑制IκB磷酸化形成p-IκB降解从而导致细胞核内p65相对表达水平明显降低(p<0.05),而mi R-451 inhibitor可以促进IκB磷酸化形成p-IκB降解从而引起细胞核内p65相对表达水平明显升高(p<0.05);细胞免疫荧光化学显示,mi R-451 mimics可以抑制p65蛋白向细胞内内转移而mi R-451 inhibitor可以促进p65蛋白向细胞内内转移;实时荧光定量PCR和Ch IP检测结果发现mi R-451 mimics可以抑制p65蛋白与TNF-α、IL-18、MYD88和ICAM-1启动子的结合并抑制它们的转录(p<0.05),而mi R-451 inhibitor可以促进p65蛋白与TNF-α、IL-18、MYD88和ICAM-1启动子的结合并促进它们的转录(p<0.05);mi R-451 mimics和inhibitor可以抑制或者促进纤维化因子TGF-β1、FN、collagen I和collagen IV的转录(p<0.05)。结论mi R-451通过抑制靶基因LMP7从而抑制NF-κB转录因子的活性,导致NF-κB转录因子与下游的促炎症因子TNF-α、IL-18、MYD88和ICAM-1基因启动子的结合能力降低,从而引起促炎症因子转录降低;同时mi R-451也抑制了促纤维化因子TGF-β1、FN、collagen I和collagen IV转录。第三部分mi R-451调控糖尿病肾病小鼠LMP7/NF-κB信号通路的研究目的上调mi R451在db/db糖尿病肾病小鼠体内对LMP7/NF-κB信号途径和促炎症因子转录的影响,并且观察上调mi R451对db/db小鼠尿微量白蛋白、血糖、肾小球肥大,系膜扩增以及肾纤维化的影响,为探索mi R-451调控糖尿病肾病分子机制提供理论基础。方法通过尾静脉注射mi R-451 agomir到已经发生糖尿病肾病的db/db小鼠体内,监测血糖和尿微量白蛋白的变化,直到经过mi R-451治疗的db/db小鼠血糖和尿微量白蛋白显著低于未治疗的db/db小鼠;通过实时荧光定量PCR检测mi R-451在各组db/db小鼠肾脏中的相对表达水平;通过实时荧光定量PCR和western blot检测LMP7在各组db/db小鼠肾脏中的相对表达水平;western blot检测各组db/db小鼠肾脏中NF-κB转录因子关键蛋白p-IκB、IκB和p65相对表达水平;通过实时荧光定量PCR检测促炎症因子TNF-α、IL-18、MYD88和ICAM-1相对表达水平;各组肾组织经过H&E染色后观察并统计肾小球肥大和系膜扩增的情况;各组肾组织经过Masson染色后观察肾纤维化的情况,并通过实时荧光定量PCR检测促纤维化因子TGF-β1、FN、collagen I和collagen IV的相对表达水平。结果在mi R-451 agomir治疗的糖尿病肾病db/db小鼠中mi R-451的相对表达水平明显高于没有注射mi R-451的db/db小鼠(p<0.05);经过mi R-451 agomir治疗后,LMP7的相对表达水平和NF-κB转录因子的活性明显受到了抑制(p<0.05);经过mi R-451 agomir治疗后,促炎症因子TNF-α、IL-18、MYD88和ICAM-1相对表达水平在糖尿病肾病db/db小鼠肾脏组织中明显下降(p<0.05);上调mi R-451可以降低血糖和尿微量白蛋白,改善肾小球肥大、系膜扩增以及肾纤维化,抑制促纤维化因子TGF-β1、FN、collagen I和collagen IV的相对表达水平(p<0.05)。结论在糖尿病肾病db/db小鼠体内,上调mi R-451明显抑制LMP7表达和NF-κB转录因子活化,从而抑制了促炎症因子的转录;mi R-451治疗明显降低糖尿病肾病db/db小鼠的血糖和尿微量白蛋白,改善肾脏的病理变化,缓解肾纤维化的发展,对糖尿病肾病具有保护作用。