女性在体内激素水平剧烈变化时期,容易表现出明显的抑郁症状。产后抑郁症(postpartum depression,PPD)是一种严重的身体病理状态,多出现在产后前4周内,大约影响10%-20%的母亲。雌激素(estrogen,E2)和孕激素(progesterone,P4)在孕期时的水平,比正常月经周期分别增加100倍和10倍。在分娩过程中,当胎盘排出体外后,E2和P4的水平迅速降低,在产后很长一段时间内维持在较低水平。PPD的发生可能与这段时期性腺激素水平的剧烈变化有关。研究表明,对PPD患者行E2治疗可减轻抑郁症状,对啮齿类动物在产后行高水平E2治疗可预防抑郁样行为。这些研究结果提示产后E2水平的降低在PPD的发病中发挥着一定作用。然而,E2撤退导致PPD的神经生物学机制尚未被阐明。海马在抑郁疾患的病因学中发挥着重要作用。成年哺乳动物海马齿状回(dentate gyrus,DG)亚颗粒区(subgranular zone,SGZ)的神经干细胞能分化成神经细胞,即神经再生过程。研究表明哺乳类动物在整个成年期,大脑海马DG区不断地产生新生神经元,并且与成熟颗粒细胞的死亡形成一定比率。海马DG区的新生神经细胞与成熟的颗粒细胞具有相同的形态和功能特征,能与海马CA3区的神经元和内嗅皮层的传入纤维建立突触联系,融入海马的突触环路,整合入神经网络。研究表明海马DG区新生神经元的数目在孕期显著增加,产后则立即减少。在激素模拟的孕期(hormone-simulated pregnancy,HSP)实验中,海马神经细胞增殖在苯甲酸雌二醇(estradiol benzoate,EB)撤退后第四天显著减少。目前有关海马神经再生与PPD的关系少有报道,特别是E2是否参与PPD海马神经再生过程的调节,尚未被完全阐明。研究表明,E2可通过Src介导的信号转导途径增强NMDA受体(N-methy-D-aspartate receptor,NMDAr)亚基 NR2B 的磷酸化。NMDAr 的激活在海马DG区新生神经元的存活及神经环路的整合过程中发挥着重要作用。但HSP后EB的撤退是否通过下调NMDAr,从而影响海马新生神经元的存活,以及NR2B及Src信号通路在PPD发生发展过程中是否发挥着作用,这些问题均尚未清晰。脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)在成年神经发生过程中也发挥着重要作用。HSP后EB的撤退是否对脑内BDNF的水平产生影响,也需进一步研究。本课题使用HSP模型ICR小鼠作为工具鼠,重点探讨EB对其情感行为及海马神经再生的影响,并探讨在该过程中发挥作用的分子机制,为PPD的治疗提供新的理论依据。研究目的1.探讨产后EB撤退对PPD小鼠情感行为及海马神经再生的影响。2.研究产后EB撤退对PPD小鼠海马神经再生产生影响的分子机制及信号通路。第一部分产后雌激素撤退对小鼠情感行为及海马神经再生的影响材料与方法1.实验动物:15-16周龄ICR雌性小鼠,实验起始时体重为32-35 g,动物在南京医科大学动物研究中心恒定环境中生存(温度23 ±2℃,湿度55 ±5%,12:12白天/黑夜循环),所有实验操作前后均自由饮水、进食。2.动物模型的建立:将小鼠于异氟醚麻醉下行双侧卵巢切除术(ovariectomy,OVX组)。假手术组(对照组)在与OVX小鼠相同条件下进行手术操作,除了未切除双侧卵巢,其余手术操作步骤均相同。恢复7天之后,对OVX小鼠给予EB和P4皮下注射,将EB(0.5 μg/天)和P4(0.8 mg/天)溶解于0.1 ml实验用蓖麻油,于每日8:30注射,持续16天,之后7-11天持续单独注射EB(10μg/天)(图1)。3.动物分组:(1)对照组:即假手术OVX小鼠,以蓖麻油处理;(2)HSP组:OVX小鼠以EB/P4处理16天,继以高剂量EB处理12天;(3)EW组:OVX小鼠以EB/P4处理16天,继以高剂量EB处理7天;(4)OVX组:与EW小鼠HSP模型建立后停用EB的同一天,对小鼠行双侧OVX;(5)OVX/EB组:OVX小鼠以高剂量EB处理5天。4.在实验进程的第25-28天实施动物的情感行为学检测:(1)矿场实验(open-field test,OFT):评价动物的自发活动性和探究行为;(2)高架十字迷宫实验(elevated plus maze test,EPM):评价焦虑样行为;(3)强迫游泳实验(forced swim test,FST):评价抑郁样行为;(4)悬尾实验(tail suspension test,TST):评价抑郁样行为。5.标记海马新生神经细胞:在实验进程第1天和第17天,对小鼠分别行三次BrdU(50 mg/kg)腹腔注射,间隔8h。在EB撤退后第五天检测异种BrdU免疫阳性(BrdU+)细胞,以分别确定28天和10天BrdU+细胞的数目。6.用BrdU与神经特异性核蛋白(neuron specific protein,NeuN)双标记行免疫荧光染色,检测BrdU+/NeuN+免疫阳性细胞数目,评估成熟的新生神经细胞。7.用Doublecortin(DCX)免疫染色,测量DCX+细胞的数目以及DCX+纤维的密度,以检测新生神经细胞突起的生长。结果和小结1.情感行为学检测:(1)OFT检测:小鼠运行的距离在各组之间无显著性差异。(2)EPM检测:与对照组相比,EW组小鼠在明臂滞留的时间显著缩短;相反,HSP组小鼠、OVX组小鼠及OVX/EB组小鼠在明臂滞留的时间与对照组相比无显著变化。(3)FST和TST检测:与对照组相比,EW组小鼠在FST和TST中的不动时间显著延长;HSP组小鼠、OVX组小鼠及OVX/EB组小鼠在FST和TST中的不动时间与对照组相比,无显著差异。上述结果表明,HSP后EB的撤退导致小鼠发生抑郁和焦虑样行为。2.EB撤退后海马DG新生神经元的存活和神经突的生长:(1)28天BrdU+细胞及BrdU+/NeuN+细胞的数目在各组的变化:与对照组相比,EW组小鼠显著减少,HSP组小鼠显著增加,而OVX组小鼠及OVX/EB组小鼠则无显著变化;(2)10天BrdU+细胞的数目在EW组小鼠或OVX组小鼠两组均无显著变化,而在HSP组小鼠和OVX/EB组小鼠两组均显著增加。(3)DCX+细胞的数目在各组的变化:与对照组小鼠相比,EW组小鼠和OVX组小鼠均无显著性差异,而HSP组小鼠和OVX/EB组小鼠两组均显著增加。(4)每个DCX+细胞DCX+纤维的密度:与对照组相比,EW组小鼠显著降低,而HSP组小鼠和OVX/EB组小鼠无显著变化。上述结果表明,HSP后EB的撤退导致小鼠海马新生神经元的存活和神经突的生长受损。结论产后EB撤退可导致小鼠海马神经再生障碍,产生抑郁和焦虑样行为。第二部分产后雌激素撤退对小鼠海马神经再生产生影响的分子机制材料与方法1.实验动物:15-16周龄ICR雌性小鼠,实验起始时体重32-35 g,动物在南京医科大学动物研究中心恒定环境中生存(温度23±2℃,湿度55±5%,12:12白天/黑夜循环),所有实验操作前后都自由饮水、进食。2.在实验进程第24-28天行药物处理:将NMDAr激动剂NMDA给予EW组小鼠(腹腔注射),在相同实验进程将NR2B受体拮抗剂Ro25-6981和Src抑制剂Dasatinib给予HSP组小鼠和对照组小鼠,均行每日腹腔注射;对HSP组小鼠和对照组小鼠行右侧脑室内反复注射TrkB受体抑制剂K252a,在相同的时间进程给予对照小鼠和HSP组小鼠右侧脑室相同容量的溶媒注射。3.情感行为学检测(于实验进程第26-28天、每次给药后3-4 h进行):(1)检测EPM中在明臂的滞留时间,评价焦虑样行为。(2)检测FST中的不动时间,评价抑郁样行为。(3)检测TST中的不动时间,评价抑郁样行为。4.海马DG新生神经元的存活和神经突的生长(于实验进程第28天进行):(1)在实验进程第1天,对小鼠分别行三次BrdU(50mg/kg)腹腔注射,间隔8 h。在实验进程第28天检测BrdU+细胞。(2)行DCX免疫染色,检测DCX+纤维的密度。5.蛋白质印迹(Westernblot)分析(于实验进程第28天进行):检测海马组织NR2B及Src的磷酸化(p-NR2B和p-Src)水平,以及BDNF水平。6.逆转录聚合酶链反应(Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)(于实验进程第28天进行):检测海马组织BDNF mRNA。7.对HSP组小鼠和对照组小鼠行脑室内TrkB受体抑制剂K252a或溶媒连续注射5天,检测BDNF的水平对海马新生神经元存活和神经突生长的影响。结果和小结1.海马组织p-NR2B和p-Src的水平:(1)与对照组相比,p-NR2B和p-Src的水平在EW组小鼠显著降低,在OVX组小鼠无显著变化,在HSP组小鼠和OVX/EB组小鼠均显著升高。(2)给予Src抑制剂Dasatinib 5天可抑制HSP组小鼠和OVX/EB组小鼠p-NR2B水平的升高。上述结果表明,EB的使用使HSP组小鼠和OVX/EB组小鼠海马组织NR2B磷酸化水平增加,该作用依赖于Src的激活。2.情感行为学检测:(1)用NMDA处理后,EW组小鼠增加了在EPM中明臂的滞留时间、缩短了在FST和TST中的不动时间。(2)用Ro25-6981处理后,对照组小鼠和HSP组小鼠均减少了 EPM中在明臂的滞留时间、增加了 FST和TST中的不动时间。(3)用Dasatinib处理后,HSP组小鼠减少了 EPM中在明臂的滞留时间、增加了 FST和TST中的不动时间。上述结果表明,NMDAr激动剂可逆转EB撤退所诱导的情感障碍,NMDAr拮抗剂和Src抑制剂可阻断EB对情感障碍的保护作用。3.BrdU+细胞的数目及DCX+纤维的密度:(1)NMDA的使用使EW组小鼠28天BrdU+细胞的丧失减少,但对DCX+纤维的密度无显著影响。(2)Ro25-6981的使用使对照组小鼠和HSP组小鼠28天BrdU+细胞的数目减少,使对照组小鼠DCX+纤维的密度降低。(3)Dasatinib的使用使HSP组小鼠28天BrdU+细胞的数目减少,对对照组和HSP组小鼠DCX+纤维的密度无显著影响。上述结果表明,NMDAr激动剂可逆转EB撤退所诱导的海马神经再生障碍,NMDAr拮抗剂和Src抑制剂可阻断EB对海马神经再生的保护作用。4.海马组织BDNF水平(分别用RT-PCR和Western blot检测):与对照组相比,BDNF mRNA和BDNF蛋白的水平在EW组小鼠和OVX小鼠组均显著降低,但在HSP组小鼠和OVX/EB组小鼠无显著变化。上述结果表明,HSP后EB撤退可降低海马组织BDNF水平。5.ICV注射K252a对对照组小鼠和HSP组小鼠海马新生神经元的存活和神经突生长的影响:(1)ICV注射K252a后,对照组小鼠和HSP组小鼠DCX+纤维的密度均降低,但28天BrdU+细胞的数目未受影响。(2)ICV注射K252a与注射安慰剂的HSP组小鼠之间相比,无论在EPM中明臂的滞留时间,还是在FST和TST中的不动时间,均无显著变化。(3)ICV注射K252a与注射安慰剂的对照组小鼠之间相比,无论在EPM中明臂的滞留时间,还是在FST和TST中的不动时间,均无显著变化。上述结果表明,EB撤退后BDNF水平的降低可使海马新生神经元细胞的神经突发育不良,但不足以损害成熟新生神经元的存活。结论HSP后EB的撤退可通过Src信号通路下调NMDAr功能,导致海马神经再生障碍,产生抑郁和焦虑样行为。NMDAr激动剂对PPD可产生一定治疗效果,并且具有保护海马神经更新的能力。