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硫磺矿硫化叶菌(Sulfobus solfataricus)属于古菌中的泉古菌界,其最适生长温度约为80℃,最适生长pH约为3。硫磺矿硫化叶菌基因组编码三种B家族DNA聚合酶(Sso pol B1、Sso pol B2和Sso pol B3)。到目前为止,只有Ssopol B1的性质被系统研究而Sso pol B2和Sso pol B3的活性还未见报道。
论文的第一部分工作是Sso pol B1生化性质的研究。凝胶阻滞实验结果显示,Sso pol B1对引发模板DNA的亲和力为对单链DNA的亲和力的2倍。在体外,Sso pol B1的连续性较低,与DNA一次结合只能连续地掺入约6个核苷酸。此外,与其他复制型DNA聚合酶相似,Sso pol B1不能跨越脱嘌呤/脱嘧啶损伤位点进行DNA合成。
论文的第二部分研究Sso pol B1在高温条件下合成DNA的保真性。M13mp2正向突变分析的结果显示,Sso pol B1发生碱基取代和移码突变的错误频率分别是8.1×10-6和1.5×10-6。Sso pol B1的保真性接近于一些原核生物和噬菌体复制型DNA聚合酶的保真性,而高于一些真核生物复制型DNA聚合酶的保真性。在Sso pol B1催化DNA合成时引起的自发突变中:单碱基取代占2/3,其中C→T取代占单碱基取代的58％；移码突变约占19％。此外,我们发现,在反向突变分析中,Sso pol B1在70℃时的保真性比在55℃时高2.9倍；Mg2+比Mn2+更有利于该酶忠实地合成DNA；低pH也有利于该酶的保真性；染色体结合蛋白Ssh7不影响其保真性。Sso pol B1的外切活性对该酶保真性的贡献较小。稳态动力学分析显示,Sso pol B1外切活性缺失突变体(Sso pol B1 exo-)的错误频率为10-5-10-4,并且该酶的保真性主要由该酶对错误核苷酸和正确核苷酸Km值的差别决定。
论文的第三部分是关于Sso pol B1保真性的预稳态动力学分析。运用预稳态动力学的方法,发现在37℃、pH7.5时,Sso pol B1 exo-的错误频率为10-6-104。Sso pol B1对正确核苷酸的亲和力比对错误核苷酸的亲和力高109-918倍。Sao polB1利用核苷酸结合步骤和化学催化步骤阻止错误核苷酸的掺入。反应温度对Ssopol B1 exo-保真性的影响较小。低pH使该酶的保真性提高24倍。Sso pol B1的外切活性使该酶的保真性提高11倍。由此推测,Sso pol B1在细胞内的错误频率为10-8-10-6。
论文的第四部分是关于Sso RFC对Sso pol B1活性影响的研究。我们发现,Sso RFC不仅能够促进Sso pol B1的聚合活性和外切活性,而且也能够促进PfuDNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、Klneow DNA聚合酶和T4 DNA聚合酶的活性,提示Sso RFC对DNA聚合酶活性的促进作用可能不依赖蛋白与蛋白的互作。凝胶阻滞实验结果显示,Sso RFC促进Sso pol B1结合引发模板DNA和单链DNA的能力。Sso RFC不影响Sso pol B1掺入正确核苷酸的Km值,但可提高其Vmax值。此外,我们还发现,Sso RFC不影响Sso pol B1掺入错误核苷酸的频率。根据上述结果,我们推测,Sso RFC结合引发模板DNA中引物的3’末端,使该末端易于被Sao pol B1利用,从而促进该酶的活性。由此可知,Sso RFC不仅是滑动夹的装载因子,也是一个调节因子:抑制引发酶的活性,促进Sso pol B1的活性,使得DNA复制能够高效有序地进行。