利用具备N-糖基化途径的家蚕细胞系表达糖基化蛋白研究

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昆虫-杆状病毒表达系统以其效率高、周期短、成本低的优点,自其介导的外源基因表达首次被报道以来,已有近千种外源蛋白在该系统中得以成功表达.设想如果可以将昆虫-杆状病毒表达系统表达的蛋白质应用于生产、生活和临床中,必将具有重大现实意义.但是,随着研究的深入却发现该系统存在一定缺陷,主要表现在昆虫/昆虫细胞内表达的蛋白质往往不具备复杂的蛋白质糖链.然而,在翻译之后可以直接发挥作用的蛋白质很少,绝大多数蛋白质需要修饰后才能发挥其生物学功能,并且糖基化修饰是蛋白质翻译后修饰中最重要的之一.因此对昆虫-杆状病毒表达系统的改进的关注点主要集中在了增加其表达的糖基化蛋白的复杂程度,使其产生生物功能和活性类似于哺乳动物的糖蛋白。   本研究是在胡嘉彪等获得的转入哺乳动物细胞4种糖基转移酶基因的家蚕BmN转基因细胞的基础上,通过酶活检测以及糖基化蛋白表达和糖型鉴定的方法来验证转基因细胞的功能。在酶活检测方面,比较了正常BmN细胞和转基因细胞的beta-1,4-半乳糖转移酶(GalT)活性.在糖蛋白表达和检测方面,利用正常BmN细胞和转基因细胞分别表达糖基化蛋白—人丁酰胆碱酯酶(hBchE),并利用基质辅助激光解吸附飞行时间质谱法(MALDI-TOF-MS)检测细胞总糖糖型,来比较两种细胞的差异,以达到验证其糖基化作用的目的。   结果表明本实验室所构建的含人源性糖酰化酶基因的转基因家蚕细胞系,经过传代15代,细胞系生长良好,状态正常,呈梭型,贴壁好,转基因细胞在紫外光下可见绿色荧光;测定转基因细胞中beta-1,4-半乳糖转移酶(GalT)活性表明,转基因细胞具有GalT活性;转基因细胞可以与正常细胞一样表达外源糖基化蛋白-人丁酰胆碱酯酶(hBchE);转基因细胞和正常BmN细胞表达人丁酰胆碱酯酶后的细胞总糖糖型存在差异,正常BmN细胞有糖型结构8种,转基因细胞在此基础上多了5种糖型,其中3种是杂合型或复杂型,2种是高甘露糖型,说明转基因细胞中的杂合型和复杂型N-糖链更接近于哺乳动物水平.
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