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在自由基生物学与医学领域,自由基的特异性检测与分析是一个热点和难点。作为超氧阴离子自由基的特异性探针,环状排列黄色荧光蛋白(cpYFP)具有重要的应用前景。然而,目前仅有极少数论文简单报道了cpYFP在大肠杆菌中的表达与分离。为了高效获得高品质的cpYFP,本论文在大肠杆菌BL21(DE3)表达的基础上,探索cpYFP在毕赤酵母X33的表达,并比较了它与大肠杆菌BL21(DE3)表达的异同。针对获得的高表达重组毕赤酵母菌株,通过甲醇诱导使重组cpYFP分泌表达到发酵液中；发酵液经乙醇沉降,Macro-Prep DEAE弱阴离子交换色谱分离纯化,得到电泳纯的目的蛋白；最后,对目的蛋白的分子量、糖基化、特异性和热稳定性进行了初步的表征。实验得到的结果如下：1.采用基因工程方法,成功构建了能表达cpYFP的大肠杆菌及毕赤酵母菌株。2.对比分析两种不同表达体系的cpYFP,结果表明毕赤酵母胞外分泌的目的蛋白不仅背景较大肠杆菌表达的清晰,而且荧光强度为后者的3倍。同时,毕赤酵母表达的重组cpYFP对超氧阴离子自由基反应的灵敏性高于大肠杆菌表达的cpYFP。3.摇瓶培养发酵时,毕赤酵母接种14 h后进入对数期,48 h后进入稳定期,确定转接扩大培养时间为24h；通过设计一次回归正交试验,得出cpYFP在毕赤酵母表达体系的最佳诱导方案：28℃,pH7.0,诱导5天。4.发酵液经80%乙醇沉降,Macro-Prep DEAE弱阴离子交换色谱分离,得到电泳纯的目的蛋白。5.质谱分析重组cpYFP的分子量为45.54 kD较理论分子量(32.52 kD)大,经N-糖苷酶和p-消去实验,表明该蛋白经过N-糖基化及O-糖基化修饰。6.重组cpYFP对H202不敏感,与·OH-反应荧光强度略微下降,但对·O2-敏感,荧光强度明显增强。7.重组cpYFP具有较好的热稳定性,即使在100℃处理10 min,其荧光强度仍然保留93.41%。综上所述,本实验构建的重组毕赤酵母菌能够高效表达重组cpYFP,其产物易于纯化,特异性高,热稳定性较好。可见毕赤酵母可作为制备重组cpYFP的良好体系,为cpYFP在自由基生物学领域的广泛应用提供充足的原料来源。