空肠弯曲杆菌基因诊断方法的建立及其应用

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空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni,C.jejuni)被认为是人类主要食源性病原菌之一,对动物也能致病。由于空肠弯曲杆菌特殊的生长条件和容易进入不可培养但存活的状态(Viable but nonculturable,VNC),所以传统的生化鉴定结果不一定可靠,并且是一项费时而繁琐的工作。因此建立一种快速、简洁、准确、敏感的检测食品和水中空肠弯曲杆菌方法,并对国内食品和水中空肠弯曲杆菌污染情况进行调查是一个重要的研究课题。 本实验研究根据空肠弯曲杆菌VS1基因的序列设计一对特异引物(VS-F和VS-R),建立了一种快速从食品和水中检测空肠弯曲杆菌的定性PCR方法,并在此基础上以LightCycler为平台建立了两种定量检测空肠弯曲杆菌的实时荧光定量PCR方法(Real-time PCR)。一种是利用SYBR Ⅰ染料能特异与双链DNA结合而发荧光的特性,建立real-time PCR方法来定量检测空肠弯曲杆菌;另外一种是利用荧光能量传递技术(Fluorescene resonance energy transfer,FRET)和DNA合成酶的5’→3’活性,设计一条TaqMan探针,建立real-time PCR方法来定量检测空肠弯曲杆菌。研究表明,三种PCR方法对空肠弯曲杆菌能特异的扩增出358bp片段,而其它结肠弯曲杆菌、胎儿弯曲杆菌、霍乱弧菌、创伤弧菌、沙门氏菌、大肠杆菌等均不能扩增出该片段,并且两种real-time PCR方法整个实验能在60min内完成。三种PCR方法的敏感度分别为8CFU/ml,5CFU/ml和5CFU/ml。用培养法、定性PCR方法和基于TaqMan探针的real-time PCR方法对南京地区的屠宰场、超市和牛奶场等地300份鸡肉、300份生牛奶及300份井水及自来水进行空肠弯曲杆菌调查。定性PCR方法结果表明,30.6%(92/300)的鸡肉为阳性、27.3%(82/300)的生牛奶为阳性、13.6%(41/300)的水为阳性。Real-time PCR定量检测结果表明三种样品受空肠弯曲杆菌污染的程度较重。对用培养法和PCR法的检测结果进行比较,提示被PCR检测出来的空肠弯曲杆菌有一部分是死菌或VNC。上述结果说明,居民消费的鸡肉、牛奶和水如果加工不当或饮食习惯不卫生,会对其健康构成潜在的威胁。本实验结果为我国食品卫生和公共卫生的管理,食品生产加工企业的危害分析与关键控制点(HACCP)质量保证体系的建立及卫生检验提供了必要的依据。
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