目的从表观遗传学角度出发,对先天性小耳畸形残耳软骨组织及正常耳软骨组织的全基因组DNA甲基化水平进行对照研究,通过甲基化DEP和ROI深度分析,从中挖掘筛选出与生长发育密切相关的Wnt信号通路,验证其相关甲基化差异基因Wnt1.Wnt11基因的表达差异,通过对Wnt/PCP通路的干预了解其在耳廓软骨细胞增殖与凋亡中的作用,并结合甲基化水平的异常探讨其在先天性小耳畸形发病中可能的作用机制。方法1.通过MeDIP Chip技术获得先天性小耳畸形全基因甲基化谱并对其进行深度GO和Pathway分析,筛选可能与本病相关的信号通路和相关分子。2.对先天性小耳畸形患者和非耳畸形患者软骨组织,及同一患者残耳及正常软骨组织中的wnt1和wnt11基因表达进行Real-time PCR检测,验证基因表达状态是否与甲基化芯片中Wnt信号通路富集的结果相一致。3.CCK-8法检测同一先天性小耳畸形患者来源的正常软骨和残耳软骨细胞的增殖活性,Annexin Ⅴ法检测正常软骨细胞及残耳软骨细胞的凋亡情况。4.分别在同一先天性小耳畸形患者来源的正常软骨和残耳软骨细胞组中加入JNKinhibitor Ⅱ、同时加入JNK inhibitor Ⅱ和5氮杂胞嘧啶苷,Real-time PCR检测不同组间wnt1和wnt11基因表达的变化,Western Blot法检测Wnt1和Wnt11蛋白含量的变化,确定Wnt/PCP信号通路被充分阻断后,CCK-8法检测各组正常软骨和残耳软骨细胞的增殖活性,Annexin Ⅴ法检测各组正常软骨细胞及残耳软骨细胞的凋亡情况。结果1.对先天性小耳畸形DNA甲基化谱的深度分析,GO分析和Pathway筛选分析发现,Wnt信号通路是较为富集并且可能与本病发生密切相关的信号通路。其相关基因wnt1及wnt11在正常软骨的启动子区和CpG岛呈现高甲基化趋势,而残耳软骨中甲基化水平较低。结合GO和Pathway的结果,构建了存在甲基化差异表达的Wnt信号通路Network。o并针对该通路中存在甲基化改变的wnt1和wnt11基因及其所在的具体信号通路进行进一步研究。2.对先天性小耳畸形患者和非耳畸形患者软骨组织中wnt1及wnt11的基因表达均未见明显差异。而对同一先天性小耳畸形患者来源的残耳软骨组织中的wnt11基因表达明显高于正常软骨组织。3.同一先天性小耳畸形患者来源的正常软骨和残耳软骨第3代细胞形态与原代及1、2代细胞无明显差异。残耳软骨细胞的增殖能力和凋亡情况与正常软骨细胞相比未见明显差异。4.分别向残耳软骨细胞及正常软骨细胞中加入JNK inhibitor Ⅱ和同时加入JNKinhibitor Ⅱ及5氮杂胞嘧啶苷后,第3代残耳软骨细胞及正常软骨细胞的形态与对照组相比均没有发生明显的改变。通过实时定量PCR的检测,残耳软骨细胞及正常软骨细胞中JNK inhibitor Ⅱ组wnt11基因的表达均低于对照组。Western Blot检测发现残耳软骨细胞及正常软骨细胞中JNK inhibitor Ⅱ组Wnt11蛋白的表达均低于对照组。在Wnt/PCP信号通路被有效阻断后,正常软骨细胞和残耳软骨细胞JNKinhibitor Ⅱ组的增殖能力均高于对照组,其生长曲线的拟合也与该结果相吻合。在细胞凋亡的测定中,JNK Inhibitor Ⅱ组活细胞百分比明显高于对照组,总凋亡细胞百分比明显低于对照组。同时加入JNK inhibitor Ⅱ及5氮杂胞嘧啶苷组软骨细胞的增殖与凋亡与对照组相比未见明显差异。结论先天性小耳畸形全基因组甲基化芯片的深度分析及筛选发现Wnt信号通路的DNA甲基化水平存在差异,选择该通路中甲基化水平差异表达基因wnt1和wnt11基因进一步进行验证,在同一患者的配对研究中发现其残耳软骨中wnt11基因表达水平较其正常耳软骨高。这与其启动子区CpG岛DNA甲基化的状态相一致。先天性小耳畸形患者残耳软骨细胞与正常软骨细胞具有同等的增殖能力,可以作为组织工程耳种子细胞的来源选择。在耳廓软骨细胞中加入JNK inhibitor Ⅱ,有效地阻断了Wnt/PCP信号通路的传导,下调了wnt11基因的表达,促进耳软骨细胞增殖、减少凋亡。据此推断Wnt/PCP信号通路在耳廓软骨细胞增殖/凋亡中具有重要作用,胚胎发育过程中Wnt11的过表达可能与先天性小耳畸形的发病有关,其甲基化水平差异与小耳畸形发病的相关机制还需进一步深入研究。