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[目的]: 设计合成含转导域的重组神经肽PACAP-PTD(重组腺苷酸环化酶激活肽),制备及纯化PACAP-PTD和PACAP,比较其活性和穿生物屏障能力,检测PACAP特异性受体PAC1在胸腺中的表达;利用体外细胞损伤模型,确定及比较PACAP-PTD与PACAP对小鼠胸腺和脾脏淋巴细胞活性的作用;原代及传代培养小鼠胸腺上皮细胞,建立胸腺上皮细胞与胸腺淋巴细胞的共培养模型,以期明确PACAP-PTD和PACAP对小鼠胸腺微环境及功能细胞的作用。 [方法]: 原核表达系统及蛋白内含肽介导的重组PACAP-PTD及PACAP的高效制备、纯化,鉴定及其生物活性和穿生物屏障能力的比较分析;免疫组化鉴定PACAP特异性受体PAC1在小鼠机体胸腺表达;western blotting检测不同性别、年龄小鼠胸腺细胞中PAC1的表达;利用D半乳糖、环磷酰胺、地塞米松建立并筛选体外淋巴细胞损伤模型;新型细胞增殖及细胞毒性检测试剂(CCK8)比色法及AnnexinⅤ-FITC/PI流式双染检测地塞米松对胸腺、脾脏淋巴细胞单独培养及胸腺淋巴细胞与胸腺上皮细胞共培养各个加药组细胞活性的作用;组织块培养法进行原代胸腺上皮细胞的培养,观察不同时间细胞形态的变化;利用波形蛋白和角蛋白进行免疫组化鉴定;流式细胞术检测细胞凋亡;酶联免疫法测定相关细胞因子的表达。 [结果]: 1.所制备的目的蛋白PACAP-PTD通过激光飞行质谱仪测定其分子量,发现结果与理论值相符;PACAP-PTD与PACAP保护神经细胞SHSY5Y增殖活性实验,PACAP-PTD组细胞存活率为0.931±0.091,PACAP组的存活率为0.884±0.083;PACAP-PTD对血脑、气血、血睾、血胸腺生物屏障的穿膜效率分别为28.07±2.556、20.72±2.353、4.83±0.764、27.05±2.087,相对应的PACAP穿膜效率为17.23±1.603、9.26±1.872、1.56±0.324、9.78±0.953; 2.免疫组化鉴定受体分布发现PACAP的特异受体PAC1在小鼠胸腺内有阳性表达,并主要分布在胸腺上皮细胞和胸腺细胞;随着小鼠年龄的变化,PACAP特异性受体PAC1的表达与胸腺指数的变化呈代偿性负相关; 3.不同药物对淋巴细胞作用筛选细胞损伤模型的研究中发现地塞米松对胸腺淋巴细胞、脾脏淋巴细胞的增殖活性均有抑制作用,琼脂糖凝胶电泳分析加药组存在细胞凋亡; 4.PACAP-PTD及PACAP对胸腺和脾脏淋巴细胞都具有促增殖和和抑凋亡的作用,且PACAP-PTD的效果比PACAP更为明显; 5.贴壁法培养胸腺上皮细胞,免疫组化抗角蛋白显示表达阳性、抗波形蛋白显示表达阴性,可鉴定为上皮细胞; 6.细胞共培养对淋巴细胞的作用研究中发现,与对照组相比,共培养组细胞的存活率显著增加,凋亡率降低;共培养体系中,PACAP-PTD及PACAP加药组的存活率提高,凋亡率降低;PACAP-PTD提升实验组细胞因子白细胞介素1(IL-1)、白细胞介素4(IL-4)、白细胞介素6(IL-6)、转化生长因子β(TGF-β)的分泌量,与对照组相比,IL-1、IL-4、TGF-beta1的PACAP-PTD组差异均具有统计学意义(P<0.05)。 [结论]: PACAP-PTD较PACAP具有更强的保护神经细胞SHSY5Y细胞增殖活性的作用;PACAP-PTD较PACAP能更有效地穿越小鼠的血脑、气血和血睾屏障;PACAP-PTD与PACAP对小鼠胸腺淋巴细胞和脾脏淋巴细胞具有促增殖及抑凋亡活性且PACAP-PTD的作用更明显;细胞共培养模拟胸腺微环境使淋巴细胞存活率增加;共培养体系中,加入PACAP-PTD与PACAP均能增加淋巴细胞的存活率,降低凋亡率,PACAP-PTD能作用于TEC,使其分泌更多细胞因子提高淋巴细胞增殖活性。