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目的：组织工程技术为临床骨缺损的治疗带来了新的希望,应用自体骨髓间充质干细胞(autogenic BMSCs, Auto-BMSCs)在体内构建组织工程骨修复骨缺损的方法已基本成熟。然而对于同种异体骨髓间充质干细胞(allogeneic BMSCs, Allo-BMSCs),是否能成功构建组织工程骨,及移植后的免疫原性如何,仍然有很多争论。本课题拟应用同种异体BMSCs与可降解支架复合构建组织工程骨(Tissue engineered bone, TEB),并植入犬背部皮下非受力部位,探索同种异体组织工程骨的异位成骨能力,并检测同种异体BMSCs移植的免疫原性。之后进一步构建犬颅骨临界骨缺损模型,评估同种异体BMSCs复合β-磷酸三钙(β-TCP)修复大型哺乳动物颅骨缺损的可行性。方法：1.从犬骨髓血中分离纯化BMSCs,体外向成骨、成软骨、成脂三系诱导分化、鉴定。用CM-DiI对成骨诱导至第2代的BMSCs标记后进行体内示踪研究。MTT比色法测定标记前后BMSCs的增殖状况。RT-PCR检测标记细胞中Ⅰ型胶原、骨粘连蛋白、骨形态发生蛋白-2、骨钙素的表达。将标记CM-DiI后的BMSCs复合β-TCP后植入犬背部皮下,8周后取材,荧光显微镜下观察BMSCs体内转归,组织学观察标记BMSCs-TCP复合物异位成骨情况。2.同种异体BMSCs体内构建异位组织工程骨：成骨诱导至第2代犬BMSCs复合β-TCP分别植入同种异体、自体犬背部皮下,分别作为同种异体组织工程骨组(Allo-TEB组),自体组织工程骨组(Auto-TEB组),单纯β-TCP作为材料对照组(Control组)。手术前及术后3、7、14、28、56天通过流式细胞学分别检测三组的外周血T淋巴细胞亚群的变化,评估全身免疫反应情况。术后24周取材并行HE染色,通过组织学计量分析,量化比较三组的成骨情况。3.同种异体BMSCs体内构建原位组织工程骨：构建犬双侧颅骨全层临界骨缺损模型,应用同种异体、自体BMSCs-TCP复合物原位移植修复犬颅骨临界骨缺损,分别作分Allo-TEB组,Auto-TEB组,单纯β-TCP作为材料对照组。术后1、3、6、9月通过影像学量化比较三组的颅骨缺损修复情况。术后9月通过大体观察、micro-CT、生物力学和组织学检查,分别评估三组的颅骨缺损修复质量。结果：1.犬骨髓血中分离得到的BMSCs可以向成骨、成软骨、成脂细胞方向分化,CM-DiI标记BMSCs前后的细胞形态基本一致,两组间细胞的增殖率无显著性差异(P>0.05)；标记后RT-PCR可检测到Col-I、BMP-2、BGLAP、SPARC的表达,显示标记对成骨分化无明显影响。标记细胞构建的组织工程骨植入犬皮下8周后取材,标记细胞仍能激发红色荧光,且HE染色证实标记BMSCs构建的组织工程骨可在体内异位成骨。2.同种异体BMSCs体内构建异位组织工程骨：同种异体、自体BMSCs-TCP复合物均可异位成骨,24周时Allo-TEB组与Auto-TEB组比较,其成骨百分比无显著性差异(P>0.05),均显著高于单纯β-TCP对照组(P<0.001)。流式细胞学检测显示Allo-TEB组植入第3天、7天时的组内CD4+T淋巴细胞及CD4+/CD8+T高于术前及之后的其他时间点(P<0.05),随着时间的延长,Allo-TEB组、Auto-TEB组CD4+/CD8+T细胞的百分比呈先升高后降低的曲线。但Allo-TEB组、Auto-TEB组及Control组组间的CD4+T细胞计数、CD8+T细胞计数、CD4+/CD8+T淋巴细胞的百分比无显著性差异(P>0.05)。3.同种异体BMSCs体内构建原位组织工程骨修复犬颅骨临界骨缺损：术后CT三维重建及计量分析显示Allo-TEB组、Auto-TEB组的组织工程骨骨密度在术后1、3月时有所降低,但在术后6、9月时保持稳定,两组间骨密度无显著性差异(P>0.05),材料对照组骨密度随时间延长逐渐降低,在3、6、9月时明显低于上述组织工程骨组(P<0.001)。9月时标本大体观察及micro-CT显示同种异体、自体组织工程骨仍能保持颅骨的完整性,抗压能力检测显示Allo-TEB组、Auto-TEB组的组织工程骨之间无显著性差异(P>0.05)。组织学检测显示,Allo-TEB组、Auto-TEB组的组织工程骨的类骨质中有大量骨细胞、骨陷窝,在缺损边缘与正常骨之间形成了骨性连接,单纯TCP材料大部分降解,缺损区由纤维组织填充。结论：1.犬骨髓血中分离得到的BMSCs具备向成骨、成软骨、成脂方向分化的潜能。CM-Dil标记对BMSCs的生长增殖、成骨分化无明显影响。体内示踪实验证实,BMSCs可以在体内至少存活8周,且8周时BMSCs在体内异位构建的组织工程骨的成骨过程中发挥了种子细胞作用。2.同种异体BMSCs-TCP在体内构建的组织工程骨有异位成骨的作用。同种异体组及自体组的异位成骨能力在24周时无显著性差异。术后两组间的全身免疫反应无显著性差异。同种异体BMSCs没有引起明显的免疫排斥反应。3.同种异体BMSCs-TCP在体内构建组织工程骨能够原位修复犬颅骨临界骨缺损,成骨速率在早期(3月时)慢于自体组,最终(9月时)两组间无显著性差异。