论文部分内容阅读
钛(Ti)金属被广泛应用于生物医学领域,其良好的机械性能和生物安全性为种植体提供了“骨整合”的基础,纳米结构的钛表面改性又进一步促进了种植体的“骨整合”。然而,与天然牙相比种植体周围缺乏牙周膜及其终末机械感受器,理论上缺乏与天然牙相似的感知能力,但有研究发现种植体和假肢患者均具有很好的肢体运动控制能力、本体感觉和神经反馈,并由此提出了“骨感知”理论。由于这种感知能力弱,患者易忽略过大咬合力的存在,造成过度载荷并引起种植体周围骨质吸收、颞下颌关节病甚至种植体的折断,最终导致种植失败。因此研究种植体植入后周围神经的再生具有重要的临床意义。通过自组装的方法在纯钛表面构建二氧化钛(TiO2)纳米管管状结构能够获得较大的比表面积,其与骨组织的弹性模量较为接近且对成骨细胞的增殖及分化具有促进作用,利用TiO2纳米管以上的两种性能,有望为种植体的“骨整合”和“骨感知”的研究提供新的思路和选择。此外,施万细胞在周围神经的修复和再生过程中发挥了重要的生物学作用,是周围神经系统中最为主要的胶质细胞。对施万细胞的增殖、迁移、分泌等相关生物学行为进行研究,对于种植体周围“骨感知”的研究具有重要的意义。目的:本研究拟在HF-甘油电解液中通过控制电压制备不同管径的TiO2纳米管,应用超声真空吸附法将米诺环素负载至纳米管内壁,探讨管径对于TiO2纳米管的载药能力及药物释放情况的影响;研究TiO2纳米管负载米诺环素后对鼠前成骨细胞(MC3T3-E1)成骨活性的影响和对施万细胞增殖、分泌及迁移性能的影响。从成骨性能和成神经性能共同出发筛选出理想的载药剂量。期望可以构建同时具有成骨活性和成神经的双功能活性表面。方法:1、应用电化学阳极氧化法在30V、40V、50V电压下制备不同管径的TiO2纳米管TNT30、TNT40和TNT50。采用扫描电子显微镜(SEM)观察TiO2纳米管的表面形貌,X射线衍射仪(XRD)观察其晶体结构,接触角测试仪测量其接触角;2、通过超声真空吸附法将牛血清蛋白(BSA)和100mg盐酸米诺环素修饰到TiO2纳米管表面,应用X射线光电子能谱分析仪(XPS)检测药物是否负载,利用高效液相色谱分析仪检测盐酸米诺环素的载药率及释放情况,选定30V电压下制备的管径98.4±11.4 nm的TiO2纳米管为载体,分别负载5μg、20μg、50μg的米诺环素,实验分组为纯钛组(Pure titanium)、TiO2纳米管组(TNT)、TiO2纳米管负载5μg米诺环素(TNT+5MC)、TiO2纳米管负载20μg米诺环素(TNT+20MC)和TiO2纳米管负载50μg米诺环素(TNT+50MC)组;3、将MC3T3-E1细胞接种到五组材料表面,通过DAPI染色检测细胞的粘附能力,CCK-8检测细胞增殖能力,ALP活性检测试剂盒检测细胞碱性磷酸酶(ALP)活性,天狼星红染色法检测细胞胶原分泌,茜素红染色法检测细胞外基质矿化,实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测成骨相关基因的表达;4、将施万细胞(RSC96)接种到五组样品材料表面,通过流式细胞仪检测细胞活性、CCK-8检测细胞增殖能力、实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测神经修复相关基因的表达,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测神经修复相关基因的蛋白表达;5、将施万细胞(RSC96)接种到五组样品材料表面,通过划痕实验检测细胞迁移情况、蛋白免疫印迹法(Western blot)检测整合素β1(integrinβ1)及其下游信号分子黏着斑蛋白(FAK)、蛋白激酶B(Akt)、P-FAK、P-Akt的表达,利用RNA干扰技术,使integrinβ1基因沉默,观察在整合素β1基因缺失状态下,五组样品对施万细胞迁移是否存在影响。结果:1、采用电化学阳极氧化的方法,在30V、40V和50V电压下制备了管径分别是98.4±11.4 nm,136±21.9 nm和238±33.5 nm的TiO2纳米管,随着电压的提高,管径增大;经过400°C的退火热处理3h后,三种不同管径的TiO2纳米管均出现了锐钛矿晶型;三种不同管径的TiO2纳米管较纯钛接触角变小,亲水性提高,而且随着管径的增加亲水性随之增加。2、应用超声真空吸附法吸附米诺环素及BSA,XPS检测到米诺环素和BSA的特征峰,TiO2纳米管的载药率可达75-85%,载药率及缓释能力均优于纯钛表面。3、TiO2纳米管负载米诺环素可以促进MC3T3-E1细胞的早期粘附和增殖,并促进MC3T3-E1细胞的成骨分化,但对粘附初期的分化无明显影响,且TNT+5MC组和TNT+20MC组的作用最为明显,从细胞的生物相容性角度出发最适宜的米诺环素加载量为5μg和20μg。4、将RSC96细胞在接种到五组样品表面,1d、4d时细胞增殖及神经生长因子(NGF)、胶源性神经生长因子(GDNF)基因表达均无明显改变,7d时TiO2纳米管载米诺环素明显促进RSC96细胞增殖及神经生长因子(NGF)、胶源性神经生长因子(GDNF)基因表达;此外,TiO2纳米管载米诺环素对RSC96细胞的凋亡起到抑制作用,并且促进了NGF、GDNF的蛋白表达;TNT+5MC组与TNT+20MC组的促进作用最明显。5、TiO2纳米管负载米诺环素可以促进施万细胞迁移,该过程中integrinβ1及其下游信号分子p-FAK、P-Akt表达增高,表明整合素β1信号通路参与了TiO2纳米管负载米诺环素促进细胞迁移的过程;integrinβ1沉默后,TiO2纳米管负载米诺环素仍可促进施万细胞迁移,但较正常细胞迁移率低,说明TiO2纳米管负载米诺环素同时参与了其它节细胞迁移调节途径。综上,TiO2纳米管载米诺环素可以促进成骨并有助于神经感知能力的再生修复。