目的脓毒症是各种微生物及免疫原性物质引起的全身炎症反应和宿主自身免疫性损伤,其本质是大量炎症因子和炎症介质失控性释放导致的宿主自身免疫性损伤(host autoimmunity injury)。脓毒症是当今医学所面临的主要挑战之一,也是儿科疾病的死亡原因之一,进一步发展可引起严重脓毒症(severe sepsis)、脓毒症休克(septic shock)和多器官功能障碍综合征(Multiple Organ Dysfunction Syndrome, MODS)甚至死亡。德国每年脓毒症发病79000人(11.6%),严重脓毒症/脓毒症休克发病75000人(11%),全国454个ICU病房感染病人30.8%有严重脓毒症/脓毒症休克。美国每年有751000例严重脓毒症/脓毒症休克患者,病死率达28.6%。脓毒症的发病机制尚不十分明确,可能的发病机制包括:炎症因子风暴、凝血系统紊乱和微循环、线粒体功能障碍等。线粒体功能障碍在脓毒症,尤其是脓毒症休克患者的病情发展中起了很重要的作用。但在脓毒症恢复过程中,线粒体机制尚不明确。线粒体生物修复(Mitochondrial biogenesis)是维持及恢复线粒体结构与功能的一种细胞程序,在脓毒症恢复中起着重要的作用。在某些因素(尚未明确)的启动下,脓毒症器官线粒体再生修复的相关基因表达增加,可增加线粒体DNA的复制与转录,使线粒体相关的功能与结构蛋白表达增加,恢复线粒体的功能。肾脏是机体重要器官,是脓毒症时易损器官。脓毒症大鼠肾脏线粒体是否有线粒体生物修复的发生,及线粒体生物修复对脓毒症有何影响,我们对此展开研究。本课题对脓毒症大鼠肾脏的功能状态,肾脏线粒体功能状态、超微形态结构及线粒体生物修复基因表达进行研究,探讨脓毒症肾脏功能损伤与线粒体损伤及修复间的关系,进一步了解脓毒症的病理生理机制。方法1.建立动物模型及分组无特定病原(SPF)级SD雄性大鼠50只随机分为:对照组、内毒素4小时组(LPS 4h组)、内毒素24小时组(LPS 24h组)、内毒素48小时组(LPS 48h组)和内毒素72小时组(LPS 72h组),每组10只。内毒素模型组采用腹腔注射内毒素(10 mg/kg)建立脓毒症大鼠模型,对照组腹腔注射等容积生理盐水。经检测,模型组大鼠出现不同程度的心率、呼吸、体温、白细胞增高等全身炎症反应的表现,并出现内毒素血症。2.主要检测指标的方法及意义2.1运用全自动生化仪检测血清Cr、BUN水平,反映大鼠肾脏功能状态。2.2通过线粒体形态学观察和功能检测研究线粒体损伤状态。以电镜观察线粒体形态学变化,采用Flameng评分法对线粒体超微结构进行半定量评分;运用流式细胞术检测线粒体膜电位及分析肿胀程度,以反映线粒体功能与结构状态。2.3通过线粒体内氧化应激因子的变化研究线粒体损伤机制。氧化应激因子包括锰超氧化物歧化酶(Mn-Superoxidedismutasc,Mn-SOD)活性、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)浓度、还原性谷胱苷肽(Reduced glutathione hormone,GSH)活性、一氧化氮(Nitric oxide,NO)浓度以及一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase,NOS)活性。2.4通过实时荧光定量PCR检测肾脏组织线粒体DNA拷贝数水平。线粒体DNA控制着线粒体的最基本性质,线粒体DNA拷贝数与线粒体氧化磷酸化功能密切相关,通过检测其水平可以侧面反映线粒体的功能状态,同时也是反映线粒体生物修复的指标之一。2.5通过实时荧光定量PCR检测肾脏组织线粒体生物修复调控因子mRNA水平的表达。检测因子包括过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α(PGC-1α)、核呼吸因子2(NRF2)、线粒体转录因子A(Tfam)。Tfam可通过调节mtDNA轻链和重链的转录而控制mtDNA的转录和复制,Tfam可能既对mtDNA转录起调节作用,又是mtDNA稳定需要的简单蛋白质,Tfam含量与mtDNA含量相关;NRF2既可以直接调节核基因组编码的呼吸链亚基的表达,又可以调节Tfam而调节线粒体基因组的转录、翻译等,从而直接或间接起调节线粒体基因组编码的呼吸链亚基表达的作用,还可能维持线粒体mtDNA的稳定;PGC-1α是线粒体种群的主要调节物(masterregulator)。其表达增加能加强线粒体生物合成,线粒体数量增加。PGC-1α还可以辅助活化核呼吸因子,PGC-1α通过辅助激活一组特异的控制细胞代谢的核受体及非核受体转录因子从而提高线粒体生成、细胞呼吸率以及能量底物摄取和利用,以满足细胞在环境变化时能量需求的变化。3.统计方法实验数据使用统计软件SPSS 13.0进行分析,使用Excel 2003作图;先对数据进行正态性检验(One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test),各指标均满足正态性检验,计量数据描述采用(x|-)±s表示,分析采用单因素方差分析,组间两两比较采用Tukey法,相关性分析采用Pearson相关,α界定值为0.05。结果1.脓毒症肾功能损伤本研究实验结果显示:脓毒症模型组大鼠血清Cr、BUN水平在早期(LPS 4h组)就已明显升高,有恢复趋势,但血清Cr水平在LPS 72h组降至正常。与对照组相比,LPS 24h组、LPS 48h组、LPS 72h组BUN水平明显升高(P<0.01);与LPS 4h组相比,LPS 48h组、LPS 72h组明显下降(P<0.05,P<0.01)。血清Cr水平与对照组相比,LPS 4h组、LPS 24h组、LPS 48h组Cr水平明显升高(P<0. 01,P<0.05,P < 0.05),LPS 72h组Cr水平不具有统计学差异(P>0.05)。2.脓毒症肾脏组织线粒体损伤2.1脓毒症肾脏组织线粒体形态学改变电子显微镜观察线粒体超微结构结果显示:脓毒症各组均有不同程度的损伤,主要表现为线粒体肿胀、基质透明、线粒体嵴断裂,基质凝固、内外膜完整消失,呈空泡状,但LPS 72h组基本正常。Flameng评分结果显示以LPS 24h组损伤最为明显,但有逆转趋势。与对照组相比,LPS 4h组、LPS 24h组、LPS 48h组线粒体电镜半定量评分明显升高(P<0.01),LPS 72h组线粒体电镜半定量评分差异无统计学意义(P>0.05)。同时,流式细胞仪分析线粒体肿胀程度结果显示:脓毒症各组线粒体肿胀程度变化与超微结构Flameng评分基本一致。与对照组相比,LPS 4h组、LPS 24 h组肾脏线粒体肿胀程度明显升高(P<0.05,P<0.05), LPS 48h组、LPS 72h组肾脏线粒体肿胀程度差异不具有统计学差异(P>0.05,P>0.05)。2.2脓毒症肾脏组织线粒体膜电位水平的改变流式细胞仪分析线粒体膜电位结果显示:脓毒症肾组织线粒体膜电位在早期即出现下降,以LPS 24h组明显,但在LPS 48h组恢复正常。与对照组相比,LPS 4h组、LPS 24h组肾脏线粒体膜电位明显降低(P<0.05,P<0.05),LPS 48h组、LPS 72h组肾脏线粒体膜电位不具有统计学差异(P>0.05,P>0.05)。3.线粒体内源性氧化应激相关因子3.1.肾脏线粒体总SOD、MnSOD活性检测与对照组相比,LPS 72h组肾脏线粒体总SOD活性明显降低(P<0.01),LPS 4h组、LPS 24h、LPS 48h组肾脏线粒体总SOD活性不具有统计学差异(P>0.05, P>0.05,P>0.05)。与对照组相比,LPS 48h组和LPS 72h组肾脏线粒体MnSOD活性明显降低(P<0.01,P<0.01),LPS 4h组和LPS 24h组肾脏线粒体MnSOD活性不具有统计学差异(P>0.05,P>0.05)。3.2肾脏线粒体GSH活性检测与对照组相比,LPS 4h组、LPS 48h组肾脏线粒体GSH活性无统计学差异( P>0.05)。LPS 24h组肾脏线粒体GSH活性明显上升(P<0.01),LPS 72h组肾脏线粒体GSH活性明显下降(P<0.01)。3.3肾脏线粒体TNOS、iNOS活性检测与对照组相比,LPS 4h组、LPS 24h组、LPS 48h组、LPS 72h组肾脏线粒体TNOS活性明显升高(P<0.01,P<0.01,P<0.01,P<0.01)。与对照组相比,LPS 4h组、LPS 24h组、LPS 48h组、LPS 72h组心肌线粒体iNOS活性明显升高(P< 0.01,P<0.01,P<0.01,P<0.05)。3.4肾脏组织线粒体MDA水平检测LPS组大鼠肾脏线粒体丙二醛(MDA)含量各组间差异不具有统计学意义(P> 0.05)。3.5肾脏组织线粒体NO水平检测与对照组相比,LPS 4h组、LPS 48h组、LPS 72h组肾脏线粒体NO水平明显下降(P<0.05,P<0.01,P <0.05),LPS 24h组肾脏线粒体NO水平改变不明显(P>0.05)。与LPS 24h组相比,LPS 48h组肾脏线粒体NO活性差异无统计学意义(P>0.05),LPS 72h组肾脏线粒体NO活性明显下降(P<0.01)。4.肾脏组织线粒体DNA相对拷贝数实时荧光定量PCR分析各组线粒体DNA相对拷贝数结果显示:脓毒症在早期(LPS 4h组)已发生线粒体DNA相对拷贝数下降,但以LPS 24h组下降明显。与对照组相比, LPS 24h组肾脏线粒体拷贝数明显下降(P<0.05),LPS 4h组、LPS 48h组、LPS 48h组相对拷贝数差异无统计学意义(P>0.05,P>0.05,P>0.05)。5.肾脏线粒体生物修复PGC-1α、Ffam、NRF-2调控因子mRNA水平的检测实时荧光定量PCR分析各因子mRNA水平结果显示:各因子mRNA水平于LPS 4h开始表达明显上升。Tfam水平于LPS 24h组达到高峰,后回至正常水平;NRF2与PGC-1α高峰在LPS 4h组,后开始下降,在LPS 48h及72h组回恢至正常水平。与对照组相比, LPS 4h组、LPS 24h组肾脏Tfam表达明显升高(P<0.01,P<0.01),LPS 48h组、LPS 72h组肾脏Tfam mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组相比,LPS 4h组、LPS 24h组肾脏NRF2表达明显升高(P<0.05,P<0.05),LPS 48h组、LPS 72h组肾脏NRF2 mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05,P>0.05)。与对照组相比,LPS 4h组、LPS 24h组肾脏PGC-1αmRNA表达明显升高(P<0.05,P<0.05),LPS 48h组、LPS 72h组肾脏PGC-1αmRNA表达无统计学意义(P>0.05)。6.相关性分析6.1大鼠肾功能与线粒体膜电位的相关分析相关分析结果显示:脓毒症大鼠BUN水平的变化与肾脏线粒体膜电位水平变化具有统计学意义的负相关,相关系数为r=-0.124(P<0.05)。6.2大鼠线粒体膜电位水平变化与线粒体DNA相对拷贝数变化的相关分析相关分析结果显示:大鼠肾脏线粒体膜电位水平变化与线粒体DNA相对拷贝数水平变化具有统计学意义的正相关,相关系数r=2.483(P<0.01)6.3大鼠肾脏线粒体DNA拷贝数与线粒体生物修复基因表达水平的相关分析相关分析结果显示:大鼠肾脏线粒体DNA拷贝数与Tfam、NRF2、PGC-1α表达水平具有统计学意义的负相关,相关系数(r=-0.913 P<0.05; r=-0.919 P<0.05; r=-0.894 P<0.05),即随着线粒体DNA拷贝数的下降,基因表达增加。结论1.脓毒症早期即存在肾脏线粒体损伤,与肾脏功能损伤相关,是肾脏功能损伤的原因之一,肾脏线粒体损伤呈可逆性。2.脓毒症肾脏线粒体DNA拷贝数下降是导致线粒体膜电位下降的原因之一,线粒体功能的恢复与DNA拷贝数的恢复有关。3.脓毒症线粒体生物修复基因表达在脓毒症早期开始增加,与线粒体DNA拷贝数及线粒体膜电位相关。4.脓毒症线粒体氧化应激引起线粒体损伤,但氧化应激亦可能是线粒体生物修复的启动因素。