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背景限制型心肌病是一类罕见的心肌病,临床预后差,其中一部分患者与遗传因素直接相关,致病机制因突变基因不同而存在差异,目前尚未存在针对病因治疗的有效方法。目前对于遗传性疾病研究可采用患者来源诱导多能干细胞的方法:通过向患者体细胞转入Klf4、Oct4、Sox2和c-Myc四个转录因子,使其去分化为具有多能性的细胞。进一步分化为体细胞后,可作为研究建立基因型与表现型因果关系的重要平台。我们收集了一个遗传性限制型心肌病家系,通过二代高通量测序确定了TNNI 基因448号位的单碱基错义突变(c.448A>G,p.S150P),TNNI3基因表达肌钙蛋白I(cTnI),在心肌收缩与舒张中作用关键,该突变可能为这个家系的致病突变,需要进一步的功能验证。目的建立患者诱导多能干细胞系,将其分化为心肌细胞,并通过体外蛋白结合实验探究TNNI3基因448位突变(c.448A>G,p.S150P)是否为该家系致病基因以及其致病机制。方法取患者及健康对照外周血,提取单核细胞,通过仙台病毒转染表达转录因子Klf4、Oct4、Sox2和c-Myc,使其转化为多能干细胞,并通过荧光染色特异性抗原对干细胞进行鉴定。使用化学试剂激活/抑制Wnt信号将患者诱导多能干细胞分化成为心肌细胞。由患者TNNI3基因序列构建蛋白表达载体,获得携带1个氨基酸改变的cTnI蛋白,通过ELISA实验使用识别特定氨基酸位点cTnI抗体检测局部抗原表位是否发生变化,使用固相蛋白结合实验检测突变cTnI蛋白与肌钙蛋白T(cTnT)和肌钙蛋白C(TnC)结合力是否发生变化,与TnC的实验使用了 pCa 4的钙离子浓度以比较钙离子敏感性。结果(1)经仙台病毒转染外周血单核细胞后,获得的细胞具有典型的干细胞形态学表现,免疫荧光染色均可见诱导后的多能干细胞表达特异性抗原Tra-1-60、Oct4、SSEA4;(2)通过激活/抑制诱导多能干细胞Wnt信号,获得了可自发搏动的心肌细胞;(3)蛋白结合力实验中:比较cTnI和S150P-cTnI与特异性cTnI抗体及cTnT的结合力,两者不存在显著性差异(各cTnI抗体及cTnT浓度梯度作t检验,p>0.05);pCa4时,S150P突变的cTnI与TnC结合力增强(各TnC浓度梯度作 t 检验,p<0.05)。结论采外周血提取单核细胞,经过培养促其造血祖细胞增殖后,使用仙台病毒进行转染,可获得具有分化潜能的干细胞。通过激活/抑制Wnt信号,可将患者来源诱导多能干细胞分化成为心肌细胞。S150P的突变增强了 cTnI蛋白与TnC结合的钙离子敏感性,结合患者家系中基因突变的共分离现象以及相关功能学研究,患者家系所携带TNNI3基因突变c.448A>G很大可能具有致病性。