论文部分内容阅读
食管癌是当今世界上严重威胁人类生命与健康的最常见八大恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率在我国居第四位。我国每年食管癌发病率占全球发病人数的一半以上,由于早期诊断不易和术后高复发率,5年内生存率只有10%-25%。用于治疗肿瘤的药物,如5-氟尿嘧啶(5-FU),顺铂(DDP),甲氨蝶呤(MTX),紫杉醇(Taxol)等,治疗食管癌的特异性差,对正常组织有毒副作用,因此,寻找特异性杀死食管癌细胞而对正常细胞或组织无影响的药物和提高食管癌治愈率是亟待解决的问题。白细胞介素24(Interleukin-24, mda-7/IL-24)的发现为解决这一问题带来了希望,大量研究表明,mda-7/IL-24能够特异性杀死肿瘤细胞,对正常组织或细胞无明显毒副作用。与腺病毒载体相比,以基因工程蛋白药物的形式直接给药更为安全,在大肠杆菌中表达的IL-24重组蛋白的生物活性远低于哺乳动物细胞中表达的IL-24重组蛋白。在哺乳动物细胞培养上清中分泌表达的可溶性IL-24重组蛋白(s1L-24)具有抗肿瘤功能,但其分泌表达量较低,同时,目前尚无将其作用于食管癌细胞的研究报道。我们通过分子生物学和细胞生物学方法,检测纯化的分泌表达IL-24重组蛋白对食管癌细胞Eca-109增殖和凋亡的影响,并对其作用机制进行初步探讨,取得了如下结果：1.运用Flp-In定点整合系统,将IL-24基因的编码序列整合到Flp-In-CHO(FCHO)细胞基因组的特定位点,建立了稳定分泌表达IL-24重组蛋白的定点整合工程细胞株FCHO/IL-24,在细胞培养上清和裂解液中可以检测到His6-IL-24重组蛋白的表达；2.通过亲和层析对细胞培养上清中的His6-IL-24重组蛋白进行纯化,超滤处理后HPLC测定的纯度为94.23%,ELISA测定的浓度为500ng/mL;3.MTT实验显示：IL-24重组蛋白能够显著抑制IL-24受体表达阳性的黑色素瘤细胞A375和食管癌细胞Eca-109的体外增殖能力,在蛋白浓度为50ng/mL时细胞抑制率分别为34.69%和36.21%,而对同样表达IL-24R的正常人胚肺细胞HEL和1L-24受体表达阴性的肺癌细胞A549的增殖无影响；同样,IL-24重组蛋白能够显著抑制Eca-109和A375细胞的克隆形成能力,对A549和HEL没有影响,与MTT的结果相似;4AnnexinV-FITC染色和流式细胞仪分析表明,IL-24重组蛋白能诱导A375和Eca-109细胞凋亡,重组蛋白终浓度为40ng/mL时,A375和Eca-109细胞凋亡率分别为64.5%和34.5%；5.抗体中和实验提示,单独IL-24抗体(AF1965和MAB1965)、单独IL-24R抗体(IL-20R1,IL-20R2和IL-22R)和IL-24R抗体组合(IL-20RI+IL-20R2和IL-22R+IL-20R2)都能中和IL-24重组蛋白对A375细胞和Eca-109细胞增殖的抑制作用,提示分泌表达的IL-24重组蛋白可能是通过受体介导途径抑制IL-24R表达阳性的肿瘤细胞增殖；6.IL-24重组蛋白(20ng/mL)处理A375和Eca-109细胞4h后,可使STAT3分子被磷酸化,处理1h时无作用。提示：分泌表达的IL-24重组蛋白能磷酸化STAT3分子,进而可能激活其下游分子最终诱导肿瘤细胞凋亡。抑制肿瘤细胞生长是肿瘤生物治疗的重要目标,阐明抗瘤基因发挥生物学功能的作用形式和机制是肿瘤生物学基础研究的紧迫任务。本研究在建立稳定分泌表达IL-24重组蛋白工程细胞系的基础上,获得高纯度的IL-24重组蛋白,它不仅能够特异性抑制食管癌细胞Eca-109和黑色素瘤细胞A375的增殖和克隆形成能力,还能诱导细胞发生凋亡,IL-24重组蛋白可能是通过受体介导途径和激活SATA3分子发挥作用。本研究为将具有抗瘤活性的IL-24重组蛋白以蛋白药物形式应用于食管癌的临床治疗奠定了实验基础。