第一部分动脉粥样硬化候选基因GALNT3在血管内皮细胞损伤中的作用机制研究背景与目的：冠心病是由多种遗传因素和环境因素相互作用所致的复杂疾病,也是导致全球人口死亡的首位原因。动脉粥样硬化是冠心病发生的病理基础,各种理化因素导致的内皮细胞损伤是动脉粥样硬化发生的始动环节。多肽：N-乙酰氨基半乳糖转移酶3 (polypeptide N-acetylgalactosaminyltransferase 3, GALNT3)基因编码ppGalNAc-T3,是ppGalNAc-Ts家族成员,催化蛋白质O-GalNAc糖基化,在细胞生长发育和疾病的发生发展过程中具有重要的生物学意义。目前还没有关于GALNT3在动脉粥样硬化发生发展中发挥作用的报道。本研究在汉族人群中对GALNT3基因单核苷酸多态性与冠心病的关联进行了研究。同时探讨了GALNT3基因在内皮细胞损伤中的作用及其分子机制。方法：1.利用单个位点关联分析和Gene-based关联分析的方法,在1,515例冠心病病例和5,019例对照样本中对GALNT3基因所在区域的13个SNPs进行分析,相关统计分析使用SAS^ PLINK和R等软件完成。2.应用real-time PCR方法在冠心病病例／对照(58例vs 120例)的外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)样本中,检测GALNT3 mRNA水平。3.采用基因敲低表达和过表达的策略研究GALNT3基因对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖、凋亡以及基质金属蛋白酶2 (MMP-2)和基质金属蛋白酶14 (MMP-14)表达水平的影响。利用AnaeroPack-Anaero厌氧培养产气袋建立内皮细胞缺氧培养模型,HUVECs缺氧条件下培养的同时过表达GALNT3基因,研究GALNT3基因对缺氧致内皮细胞损伤中的作用。采用MTT比色法测定细胞增殖活性,Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡,通过real-time PCR和Western Blot检测GALNT3及其靶基因的mRNA和蛋白水平。结果：1.在加性模型下,校正性别、年龄后,位点rs13427924和rs4621175(不存在连锁不平衡,r2<0.2)与冠心病达到潜在的关联(P值分别为0.008和0.03)；Gene-based关联分析结果显示GALNT3基因与冠心病存在显著关联(P=0.011)。2.冠心病病例/对照的PBMCs样本中,冠心病组GALNT3 mRNA水平下降为对照组的58.5%,有显著的统计学差异(P<0.001)。3.缺氧诱导HUVECs损伤模型中,GALNT3基因表达水平显著下降(P<0.001)。HUVECs中敲低GALNT3基因表达后促进细胞的凋亡,使MMP-2和MMP-14在mRNA和蛋白的表达水平显著升高(P<0.05)。过表达GALNT3基因显著抑制细胞凋亡,同时,MMP-2和MMP-14在mRNA和蛋白的表达水平显著下降(P<0.05)；缺氧培养条件下,过表达GALNT3基因抑制缺氧损伤引起的内皮细胞的凋亡,抑制缺氧条件下的MMP-2和MMP-14的表达。信号通路分析结果显示：敲低GALNT3的表达时,磷酸化p38水平显著升高；GALNT3基因过表达时抑制磷酸化p38蛋白水平,进一步研究发现GALNT3基因过表达时,抑制缺氧诱导的p38/MAPK信号通路的激活。结论：本研究首次揭示了GALNT3基因在冠心病中的作用。遗传关联分析显示GALNT3基因单核苷酸多态性与冠心病相关。冠心病患者PBMCs中GALNT3基因的表达水平显著下降。在血管内皮细胞中,下调的GALNT3基因通过调控p38/MAPK信号通路,促进HUVECs的凋亡,促进MMP-2和MMP-14在HUVECs中的表达水平,导致内皮细胞损伤和动脉粥样硬化的发生。第二部分高血压易感位点rs820430调控盐敏感性基因SLC4A7表达的机制研究背景与目的：原发性高血压是一种由遗传与环境因素共同作用导致的复杂疾病,具有高度的遗传异质性。近年来,应用全基因组关联研究(genome-wide association study, GWAS)发现了多个与血压或原发性高血压相关的位点或区域。本课题组前期采用GWAS结合meta分析,发现了邻近SLC4A7基因的rs820430位点与中国汉族人群的高血压风险相关,但它通过何种途径或方式调节高血压风险及相关因素仍然未知。本论文对rs820430位点调控SLC4A7基因表达的分子机制进行了初步研究。大量流行病学研究表明饮食中钠的含量直接影响血压的变化,本研究同时对包括SLC4A7基因在内的SLC4家族中5个钠离子偶联的碳酸氢根转运载体(Na-coupled bicarbonate transports, NCBTs)基因常见变异与血压对膳食钠盐的反应性的关联进行了分析。方法：1.利用TaqMan探针法检测274例健康个体rs820430位点的基因型,实时定量PCR (real-time PCR)检测其外周血单核细胞(PBMCs)样本中SLC4A7基因mRNA水平,分析rs820430基因型与SLC4A7基因表达的关系；2.应用双荧光素酶报告基因系统检测rs820430等位基因特异性的转录增强活性,利用电泳迁移率变更实验(EMSA)、电泳超迁移率变更分析(supershift-EMSA)和染色质免疫沉淀(ChIP)技术分别在体外和细胞内筛选、鉴定等位基因特异性结合的转录因子；3.利用来自“盐敏感性研究遗传流行病学协作网络”(Genetic Epidemiology Network of Salt Sensitivity, GenSalt)的共1906例研究对象。研究对象接受3天基线调查、7天低盐膳食和7天高盐膳食的膳食干预。5个NCBTs基因及其上下游5kb区域共76个SNPs纳入分析。使用混合效应模型,在加性模型、显性模型、共显性模型和隐性模型下分析SNP的基因型与低盐和高盐膳食干预下血压反应性的关联,对阳性关联的位点,计算膳食干预后血压反应的平均效应及95%可信区间。相关统计分析使用SAS和Hapoview软件完成。结果：1.高血压易感位点rs820430不同基因型影响SLC4A7基因的表达水平。与rs820430常见等位基因C的纯合子(CC)个体相比,少见等位基因T纯合子(TT)个体的SLC4A7mRNA水平显著升高(P=0.047)；2.报告基因实验结果表明,rs820430具有等位基因特异性的转录增强子活性,T等位基因的转录活性是C等位基因的1.3倍；EMSA结果显示rs820430的T等位基因与核蛋白的结合能力强于C；supershift-EMSA鉴定出转录因子cFOS与rs820430位点的T等位基因特异结合；ChIP实验在细胞内水平证明cFOS与rs820430位点的T等位基因结合；3.低盐膳食干预阶段,在加性模型下,SLC4A4基因的rs4254735位点与舒张压(DBP)的低盐反应性相关,如与rs4254735 GG纯合子个体相比,携带A等位基因的个体DBP(-2.91 mmHg vs -0.40 mmHg,P=5.05×10-4)下降更加明显；在共显性和隐性模型下,SLC4A7基因的rs13077400位点与收缩压(SBP)的低盐反应性相关,如在隐性模型下,与rs13077400 GG纯合子个体相比,携带A等位基因的个体SBP(-5.50 mmHg vs -0.57 mmHg,P=1.15×10-6)下降更加明显。在高盐膳食干预阶段,在加性模型、显性模型和共显性模型下,SLC4A4基因的rs10022637位点与SBP.DBP和平均动脉压(MAP)对高盐干预的反应性相关,随着rs10022637位点少见等位基因C的增加,血压对高盐干预的反应性下降,例如加性模型下,在rs10022637位点TT,CT和CC三种基因型个体血压的变化效应分别为SBP(4.62 mmHg vs 5.94 mmHg vs 6.00 mmHg,P=1.14×10-4)；DBP (1.72mmHg vs 3.22 mmHg vs 3.94mmHg,P=2.26×10-5)和MAP(2.69mmHg vs 4.13 mmHg vs 4.61 mmHg,P=2.07×10-6),上述关联关系在经过Bonfferroni多重校正之后仍有统计学意义。结论：本研究对前期高血压GWAS发现的高血压易感位点rs820430的生物学功能进行了初步研究,明确rs820430不同基因型影响SLC4A7基因的表达水平。rs820430位点具有等位基因特异性转录增强子活性,风险等位基因T特异性结合转录因子cFOS调控SLC4A7基因的表达,从而在一定程度上为rs820430与高血压的关系提供了基因功能学研究证据。同时,本研究首次报道了SLC4家族中包括SLC4A7基因在内的5个NCBTs基因常见变异与血压膳食钠盐反应性的关系,为深入探讨高血压的发病机制,探索新的高血压治疗靶点的研究提供了新的理论依据。