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目的:抗逆转录病毒治疗（antiretroviral therapy,ART）可以使HIV（Human immunodeficiency virus,HIV）感染者达到病毒血症抑制状态,但单独的ART治疗并不能彻底根除HIV,因为体内存在潜伏病毒储存库,一旦停止治疗又会诱发新的病毒血症,我们迫切需要寻找一些影响病毒储存库的因素。自然杀伤（natural killer,NK）细胞作为机体抗病毒免疫的重要淋巴细胞,在HIV疾病进展控制中发挥重要作用,但关于NK细胞对病毒储存库影响的相关研究很少。HIV感染后NK细胞上的免疫抑制性受体表达上调,并且通过多种机制抑制NK细胞功能,免疫抑制性受体在NK细胞上的表达能否对病毒储存库产生影响还未见研究。虽然一些研究报道了NK细胞上某些活化受体表达与病毒储存库的关系,但NKG2C及CD226作为调节NK细胞活化的重要受体,它们在NK细胞上的表达是否也对病毒储存库产生影响还未见研究。NK细胞可以通过细胞毒性和非毒性的方式杀伤靶细胞,但NK细胞毒性与病毒储存库的关系还未见研究。HIV us RNA和ms RNA代表的是转录活跃可能对机体产生不良影响的那部分储存库的水平,NK细胞对转录活跃病毒储存库的影响还未见研究。本实验旨在探究ART治疗后HIV感染者总NK细胞及NK细胞各亚群百分比、NK细胞上免疫抑制性受体和活化受体表达、NK细胞毒性及非毒性功能与DNA水平及转录活跃病毒储存库的关系,以及NK细胞对感染者激活储存库细胞的杀伤作用,为临床病毒储存库根治策略提供新的思路。方法:1、研究对象:本研究选取中国医科大学附属第一医院红丝带门诊HIV感染33例,这些感染者均接受ART治疗且治疗时间≥2年,治疗后病毒载量<20copies/ml。2、NK细胞表面免疫抑制性受体检测:从全血中提取PBMC,随后加入Percp-CD3、Percp-CD14、Percp-CD19、7AAD、APC-CY7-CD16、PE-CY7-CD56、APC-TIGIT、PE-LAG-3等荧光染料,4℃避光孵育20min,洗去未结合染料,利用流式细胞仪检测。3、NK细胞表面活化受体检测:从全血中提取PBMC,依次加入Percp-CD3、Percp-CD14、Percp-CD19、7AAD、APC-CY7-CD16、PE-CY7-CD56后再加入PE-NKG2C或PE-NKG2D和BV711-CD226,4℃避光孵育20min,洗去未结合染料,利用流式细胞仪检测。4、NK细胞储存颗粒酶B及穿孔素的检测:从全血中提取PBMC,加入LIVE/DEAD染料,4℃避光孵育30min,PBS洗去未结合染料。随后加入Percp-CD3、Percp-CD14、Percp-CD19、APC-CY7-CD16、PE-CY7-CD56等荧光染料,4℃避光孵育20min,洗去未结合染料。加入破膜试剂避光破膜30min,破膜洗液洗细胞。加入FITC-Perforin、PE-Granzyme B等荧光染料,4℃避光孵育20min,破膜洗液洗细胞,利用流式细胞仪检测。5、NK细胞分泌IFN-γ及脱颗粒功能检测:从全血中提取PBMC,用IL-12（10ng/ml）、IL-15（50ng/ml）、IL-18（100ng/ml）联合刺激,同时加入PE-CD107a培养24h,收集细胞前6h加入Golgi-stop。培养结束后收集细胞加入LIVE/DEAD染料,4℃避光孵育30min,洗去未结合染料。随后加入Percp-CD3、Percp-CD14、Percp-CD19、APC-CY7-CD16、PE-CY7-CD56等荧光染料,4℃避光孵育20min,洗去未结合染料。加入破膜试剂避光破膜30min,破膜洗液洗细胞。加入APC-IFN-γ,4℃避光孵育20min,破膜洗液洗细胞,利用流式细胞仪检测。6、核酸提取及RNA逆转录:从全血中提取PBMC,用Easy SepTMHuman CD4+T Cell Isolation Kit分选CD4+T细胞,计数细胞（细胞数<5million）,用QIAamp DNA Blood Mini Kit提取DNA,用RNeasy Plus Mini Kit提取RNA,测量每个样本的浓度和纯度。后用i Script advanced c DNA synthesis kit将RNA逆转录为CDNA。7、数字液滴PCR检测病毒储存库:利用QX200数字液滴PCR系统分别检测HIV总DNA、HIV us RNA及HIV ms RNA。配置PCR体系后加入DNA或CDNA模板,将混合物加入DG8 cartridge的8个样本孔中,70μl的液滴生成油放入油孔中,将cartridge放入QX200液滴生成器,随后将液滴转入96孔板中进行PCR扩增,扩增后将96孔板放入QX200TM液滴读取器进行分析。8、潜伏感染CD4+T细胞清除实验:从全血中提取PBMC,用Easy SepTMHuman CD4+T Cell Isolation Kit和Easy SepTMHuman NK Cell Isolation Kit分选CD4+T细胞和NK细胞（计数细胞）。用CD3/CD28磁珠刺激活化CD4+T细胞48h,IL-12（10ng/ml）、IL-15（50ng/ml）、IL-18（100ng/ml）联合刺激NK细胞48h,48h后离心洗去刺激物,将活化的CD4+T细胞单独或者与活化的NK细胞按1:2的比例共培养5h,培养结束后收集细胞加入LIVE/DEAD染料,4℃避光孵育30min,洗去未结合染料。随后加入Percp-CD3、APC-CY7-CD4等荧光染料,4℃避光孵育20min,洗去未结合染料。加入破膜试剂避光破膜30min,破膜洗液洗细胞。加入APC-P24,4℃避光孵育20min,破膜洗液洗细胞,用流式细胞仪检测。结果:1、HIV感染者CD56-CD16+NK细胞百分比与病毒储存库呈正相关CD56dimNK细胞百分比高的感染者HIV DNA更小（p=0.0139）,CD56dimNK细胞百分比与HIV DNA呈现负相关趋势（r=0.3569,p=0.0676）,CD56brightNK细胞百分比高的感染者HIV us RNA更小（p=0.0268）,CD56brightNK细胞百分比与HIV us RNA呈现负相关趋势（r=-0.4061,p=0.0545）,CD56-CD16+NK细胞百分比高的感染者HIV DNA更大（p=0.0332）,CD56-CD16+NK细胞百分比与HIV DNA呈正相关（r=0.4567,p=0.0166）。2、HIV感染者NK细胞上TIGIT表达水平与病毒储存库呈正相关NK细胞上TIGIT表达水平与HIV DNA、HIV us RNA及HIV ms RNA均呈正相关（p=0.023,p=0.0219,p=0.0404）,相关系数分别是0.4360、0.4753、0.4400,CD56dimNK细胞上TIGIT表达水平与HIV DNA及HIV ms RNA呈正相关（p=0.0414,p=0.0331）,相关系数分别是0.3950、0.4557,CD56dim NK细胞上TIGIT表达水平与HIV us RNA存在正相关趋势（r=0.3715,p=0.0809）,CD56-CD16+NK细胞上TIGIT表达水平与HIV DNA、HIV us RNA及HIV ms RNA均呈正相关（p=0.0204,p=0.0181,p=0.0346）,相关系数分别是0.4438、0.4881、0.4523。3、HIV感染者NK细胞上NKG2C表达水平与病毒储存库呈负相关NK细胞上NKG2C的表达水平与HIV DNA呈负相关（r=-0.3957,p=0.0411）,且NK细胞上NKG2C表达高的HIV感染者HIV DNA更小（p=0.0469）。4、HIV感染者NK细胞分泌IFN-γ水平与病毒储存库呈负相关NK细胞分泌IFN-γ水平与HIV DNA呈负相关（r=-0.4113,p=0.0458）,IFN-γ分泌多的HIV感染者HIV DNA更小（p=0.0387）,NK细胞分泌IFN-γ水平与HIV ms RNA的相关性虽无统计学意义,但有趋势显示两者之间存在负相关关系（r=-0.4208,p=0.0575）,CD56dim NK细胞分泌IFN-γ多的感染者HIV DNA更小（p=0.0387）,CD56-CD16+NK细胞分泌IFN-γ多的感染者HIV DNA及HIV us RNA更小（p=0.0145,p=0.0473）。5、TIGIT+NK细胞百分比低而NKG2C+、CD226+或IFN-γ+NK细胞百分比高的HIV感染者病毒储存库更小TIGIT+NK细胞少但NKG2C+或CD226+NK细胞多的感染者HIV DNA及HIV us RNA更小（p=0.0164,p=0.0289,p=0.0401,p=0.0140）,有趋势显示TIGIT+NK细胞少但CD226+NK细胞多的感染者HIV ms RNA更小（p=0.0649）,TIGIT+NK细胞少但IFN-γ+NK细胞多的感染者HIV DNA、HIV us RNA及HIV ms RNA更小（p=0.0041,p=0.0262,p=0.0140）。NKG2C+且CD226+或IFN-γ+NK细胞多的感染者HIV DNA更小（p=0.0140,p=0.0079）;CD226+且IFN-γ+NK细胞多的感染者HIV DNA更小（p=0.0159）。6、NK细胞可以在体外杀伤重新激活的潜伏感染CD4+T细胞HIV感染者体内的CD4+T细胞在体外经CD3/CD28磁珠刺激活化后P24+CD4+T细胞的百分比明显增加（p=0.0313）,加入活化的自身NK细胞后P24+CD4+T细胞的百分比明显降低（p=0.0313）。结论:通过研究NK细胞各亚群百分比、NK细胞表面免疫抑制性受体和活化受体表达以及功能与HIV病毒储存库的关系,我们首次发现CD56dim NK细胞百分比高以及CD56-CD16+NK细胞百分比低的HIV感染者病毒储存库更小,CD56-CD16+NK细胞百分比与病毒储存库呈负相关;NK、CD56dim以及CD56-CD16+NK细胞上TIGIT表达水平与病毒储存库呈正相关;NK细胞上NKG2C的表达水平与病毒储存库呈负相关。NK细胞IFN-γ的分泌水平与HIV DNA呈负相关,与HIV ms RNA呈现负相关趋势,NK细胞上TIGIT的表达及IFN-γ的分泌是影响病毒储存库的重要因素,NK细胞可以在体外杀伤激活的潜伏感染CD4+T细胞,通过杀伤作用直接影响病毒储存库的大小,具有缩减病毒储存库的潜能。