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真菌毒素是一些真菌在生长过程中产生的致病性、致死性的次级代谢产物,在粮食生产、贮存、加工和流通环节都有可能因为保存条件不当污染真菌造成污染。由于大多数真菌素素的毒性剧烈,并具有致癌、致畸和致突变的“三致”作用,因此各种检测方法被开发用于检测粮食谷物中的各种真菌毒素。免疫分析法具有高灵敏、快速、高通量、多残留和现场检测的优势,现已发展成为真菌毒素检测快速筛查和检测的重要手段之一。本课题采用免疫学原理,将真菌毒素半抗原偶联到蛋白载体,通过免疫和细胞筛选,制备了特异性单克隆抗体的基础上,建立起黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素M1、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮、脱氧雪腐镰刀菌烯醇和T-2毒素六种物质的快速检测方法,主要研究内容如下:(1)将真菌毒素分子衍生后制备的半抗原,通过紫外、质谱等进行鉴定后,通过活性酯法或者CDI法与载体蛋白(血蓝蛋白、牛血清白蛋白和卵清蛋白)偶联,制备了六种真菌毒素半抗原的完全抗原;通过免疫BALB/c小鼠、细胞融合和亚克隆,总共获得8株针对六种真菌毒素特异性或群选型单克隆抗体。(2)对筛选得到的8株单克隆抗体的性质进行了鉴定,其亲和常数分别为黄曲霉毒素B14.2×109L/mol(11A9)和2.29×109L/mol(5C3);黄曲霉毒素M11.28×109L/mol(G3D9)和2.29×109L/mol(H1);赭曲霉毒素A1.09×109L/mol;玉米赤霉烯酮2.26×109L/mol;脱氧雪腐镰刀菌烯醇1.6×108L/mol;T-2毒素1.35×108L/mol。并测定了其抗体亚型和交叉反应率。(3)试验优化了包被抗原和一抗使用浓度、标准品稀释液的缓冲液的pH、离子强度、甲醇含量、一抗和二抗的反应时间、显色时间等ELISA条件。在最适ELISA条件下,测得抗体的IC50分别为:黄曲霉毒素B10.043±0.003ng/mL(11A9)和0.025±0.005ng/mL(5C3);黄曲霉毒素M10.032±0.006ng/mL(G3D9)和0.035±0.005ng/mL(H1);赭曲霉毒素A0.092±0.006ng/mL;玉米赤霉烯酮0.054±0.004ng/mL;脱氧雪腐镰刀菌烯醇31.60±2.89ng/mL;T-2毒素0.431±0.019ng/mL。(4)在建立的8株单克隆抗体细胞株基础上,建立了六种真菌毒素的ELISA,并通过添加回收对方法进行了验证,其回收率均在80%~120%之间,批内批间差异均小于20%。(5)通过优化酶解条件,制备了AFB1单抗的F(ab’)2片段,通过免疫兔子,制备得到AFB1的抗独特型抗体,并对其进行了鉴定。用来开发黄曲霉毒素无毒试剂盒;通过实际样品添加回收试验,其回收率在110%~130%之间,批内批间变异系数均小于10%。(6)制备了可用于快速现场检测的AFB1、AFM1、OTA、ZEN、DON和T-2生物毒素胶体金快速检测试纸条,其检测限LOD分别为0.2、0.1、0.2、1、50和5ng/mL,cut-off值分别为0.5、0.2、1.0、2.0、100和10ng/mL。(7)制备了可以同时检测4种真菌毒素(ZEN、T-2、AFB1和OTA)的试纸条,其LOD分别为2、16、1和2ng/mL,cut-off值分别为为4、32、2和4ng/mL。