草甘膦（glyphosate,GLYP）是由美国孟山都公司在二十世纪60年代开发一种非选择性广谱除草剂。自2005年以来,GLYP的销量稳居全球农药销售排行榜首位。1995年首株GLYP抗性大豆系培育成功,此后GLYP的生产量与使用量逐年锐增。目前,GLYP已成为世界上应用最广、生产量最大的除草剂,也是目前我国使用量最大的除草剂。GLYP的长期大量施用导致环境及农作物中具有高水平的GLYP残留,对生态环境和人类健康构成了严重的威胁。2015年,世界卫生组织国际癌症研究机构将GLYP归类为2A类致癌物,即对人类可能致癌的物质。所以开发快速、灵敏、高效的GLYP检测技术对于保障农产品食品安全至关重要。GLYP的传统检测方法主要以色谱技术为主,尽管该方法具有较高检测灵敏度,但仍存在样品前处理步骤复杂,分析成本高,检测周期长和仪器设备昂贵等不足。因此,开发选择性好、灵敏度高、方便、价格低廉的GLYP快速检测方法是保障食品安全的迫切需求。与其他检测技术相比,免疫学检测技术具有检测周期短、成本低、操作简便等优势。然而,现有的GLYP免疫学检测方法则以传统的酶联免疫分析方法（ELISA）为主,相比于色谱法等仪器分析方法,ELISA的检测灵敏性较低。近年来,随着新型纳米材料和生物酶的出现,免疫分析技术快速发展,已经成为一个融合纳米技术、酶工程和基因工程等其他多学科交叉的新型分析技术,为开发更加快速、灵敏、特异的免疫学分析方法提供了新的观点和思路。基于生物功能化纳米粒子材料的新型免疫分析技术,可进一步提高免疫学检测方法的灵敏性和稳定性,弥补现有的GLYP免疫学检测方法灵敏性低、检测步骤多、检测方法单一等不足。本课题旨在结合免疫学检测技术、荧光分析技术和分子探针标记技术,利用寡聚核苷酸和金纳米粒子（AuNPs）在生物传感领域的应用优势,以ELISA检测为基础建立基于寡聚核苷酸纳米结构功能化AuNPs探针的新型GLYP免疫学检测方法。以期提高GLYP免疫学检测方法的检测水平,实现更加灵敏、快速、经济的GLYP检测。同时探究聚核苷酸功能化AuNPs探针在GLYP等小分子物质检测中的应用潜力。本论文的具体工作内容和结论如下:1.GLYP完全抗原的合成和鉴定。分别采用活化酯法和混合酸酐法合成了GLYP的免疫抗原（BSA-GLYP）和检测抗原（OVA-GLYP）。通过UV-Vis光谱扫描、琼脂糖电泳和Native-PAGE对合成的完全抗原进行分析鉴定,通过比较不同免疫抗原免疫鼠的血清的效价及抑制率,选择具有较高血清效价和抑制率的c BSA-聚醚胺-GLYP用于制备多克隆抗体。2.GLYP多克隆抗体的制备与鉴定。采用AKTA蛋白纯化系统和A蛋白抗体纯化柱对兔血清中的GLYP抗体进行纯化,并对抗体的浓度、纯度、效价和亲和力进行测定。结果显示,抗体效价为1:256000,抗体的亲和力常数为3.68×109 L mol-1,属于高亲和力抗体。3.ic-ELISA检测方法的建立。利用制备的兔抗GLYP多克隆抗体建立检测GLYP的ic-ELISA方法。线性检测范围为0.125 mg m L-1～4 mg m L-1,最低检测限为139.9μg m L-1。建立的ic-ELISA方法检测GLYP的三种结构类似物AMPA、GLUF和PMIDA的交叉反应率分别为0.61%、0.003%和0.014%,食品样品中的回收率在97.1%～99.9%之间,检测时间为3 h。4.基于AuNPs-TDNs纳米耀斑探针的间接竞争荧光免疫分析方法（AuNP-TDNs-ic-FLIA）的建立。用羊抗兔抗体和荧光染料SYBR Green I（SG）染色的四面体DNA（TDNs）同时修饰AuNPs,制备初始荧光被AuNPs通过FRET作用淬灭的具有可控荧光开启功能的AuNP-TDNs纳米耀斑探针（AuNP-TDNs nanoflare probe）,利用AuNPs的尺度效应及较大的比表面积实现对检测信号的放大。采用TEM、UV-Vis扫描光谱和荧光光谱对制备的探针进行表征,随后基于探针建立检测GLYP的间接竞争荧光免疫分析方法（ic-FLIA）。向包被OVA-GLYP的酶标板中加入GLYP抗体与待检样品混合物后进行孵育,此时样品中的GLYP与酶标板中的OVA-GLYP竞争结合GLYP抗体。洗板后加入AuNP-TDNs纳米耀斑探针进行孵育。再次洗涤后,加入二硫苏糖醇（DTT）释放探针上的耀斑DNA（TDNs-SG）,实现荧光的恢复。结果显示,该方法的检测范围为0.5μg m L-1～32μg m L-1,最低检测线为0.18μg mL-1。灵敏度比基于同一抗体的ic-ELISA方法提高了约700倍。方法检测GLYP的三种结构类似物AMPA、GLUF和PMIDA的交叉反应率均小于0.01%,食品样品中的回收率在95.5%～100.0%之间,检测时间为3.5 h。5.基于AuNP-dsDNA纳米耀斑探针的竞争荧光免疫分析方法（AuNP-dsDNA-c-FLIA）的建立。用GLYP抗体和荧光染料SG标记的dsDNA同时修饰AuNPs,制备初始荧光被AuNPs通过FRET作用淬灭的具有可控荧光开启功能的AuNP-dsDNA纳米耀斑探针（AuNP-dsDNA nanoflare probe）,同时利用AuNPs较大的比表面积实现对检测信号的放大。采用TEM、UV-Vis扫描光谱和荧光光谱对制备的探针进行了表征,并在该探针基础上建立了检测GLYP的竞争荧光免疫分析方法（c-FLIA）。向包被OVA-GLYP的酶标板中加入AuNP-dsDNA纳米耀斑探针与待检样品的混合物后进行孵育,此时样品中的GLYP与酶标板中的OVA-GLYP直接竞争结合探针上的GLYP抗体。洗涤除去未结合组分后,加入DTT释放探针上的耀斑DNA（dsDNA-SG）,实现荧光的恢复和检测信号的放大。结果显示,该方法的检测范围为62.5 ng m L-1～4μg m L-1,最低检测线为28.6 ng m L-1。检测GLYP的三种结构类似物AMPA、GLUF和PMIDA的交叉反应率均小于0.01%,食品样品中的回收率在97.5%～101%之间。该方法的检测灵敏度比基于同一抗体的ic-ELISA和AuNP-TDNs-ic-FLIA方法分别提高了4800倍和6倍。本方法采用直接竞争的检测模式进一步简化了检测程序,将检测时间从3.5 h缩短至1.5 h,检测流程更简单、省时。同时,以dsDNA-SG代替TDNs-SG作为耀斑DNA,进一步提高了探针的信号放大性能。6.基于双功能化AuNPs的条形码检测方法的建立。用GLYP抗体和dsDNA修饰AuNPs,制备同时具有GLYP识别捕获和信号扩增放大功能的AuNPs探针。dsDNA由一条巯基修饰的捕获DNA链（SH-capture DNA）和一条互补配对结合在捕获链上的条形码DNA/信号DNA（signal DNA）组成。在该探针基础上,建立了检测GLYP的条形码扩增免疫分析方法（AuNP-BB-iPCR）。向包被有OVA-GLYP的PCR管中加入AuNPs探针和待检样品的混合物进行免疫竞争反应,在此过程中样品中的GLYP与PCR管中的OVA-GLYP竞争结合AuNPs探针上的GLYP抗体。洗涤除去未结合组分后,向管中加入PCR反应体系进行real-time PCR,通过检测signal DNA的量实现对GLYP的检测。本方法对探针制备条件进行了优化,并采用TEM、UV-Vis扫描光谱、real-time PCR和SDS-PAGE等方法对探针进行了表征。结果显示,该方法的最低检测限为8.9 pg m L-1,线性范围是122.1 pg m L-1～62.5 ng m L-1。建立的AuNP-BB-iPCR方法检测GLYP的三种结构类似物AMPA、GLUF和PMIDA的交叉反应率分别为2.36%、0.02%和0.34%。在对食品样品进行的标准品添加回收实验中,回收率在98.3%～102.9%之间。本研究利用real-time PCR对探针上条形码DNA进行PCR循环扩增实现检测信号的指数放大。灵敏度比基于同一抗体的ic-ELISA、AuNP-TDNs-ic-FLIA和AuNP-dsDNA-c-FLIA分别提高了7个数量级、4个数量级（20000倍）和3个数量级（3200倍）。检测时间为3.5 h。7.结论。本研究将纳米技术、荧光标记技术和免疫学检测技术相结合,制备基于AuNPs和寡聚核苷酸的纳米材料生物传感探针。经过探针表征、条件优化和性能评估试验后证明了探针在提高GLYP免疫学检测方法的灵敏性方面的有效性。并在此基础上开发了检测GLYP的一种ic-ELISA方法和三种新型免疫学检测方法。除了ic-ELISA方法以外,其他三种方法的灵敏性均满足我国国家标准中对食品中的GLYP最大残留限量的检测标准要求。相比于国标中规定的食品中GLYP残留量测定的GC-MS标准方法,本方法不需要特殊的检测条件和昂贵的仪器,仅需要简单的孵育步骤即可在1.5 h～3.5 h内完成检测,成本低廉、操作简单。