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第一部分β-连环素在白血病细胞株中的表达和意义目的:检测白血病细胞株(K562、HL-60、Jurkat、Thp-1)中β-连环素蛋白的表达及定位情况,探讨β-连环素在白血病中表达的意义。方法:应用免疫细胞化学SP法和Western Blot法检测白血病细胞株和健康体检者外周血单个核细胞中β-连环素蛋白的表达和定位情况。结果: Western Blot结果显示4种白血病细胞株中均有β-连环素的表达,其中Jurkat、Thp-1细胞株高表达β-连环素蛋白;健康体检者外周血单个核细胞中只有少量很弱的表达。免疫细胞化学SP法显示β-连环素蛋白在Jurkat、Thp-1细胞株中有胞核的异常定位。结论:WNT信号通路的关键子β-连环素蛋白的过量表达及异常定位与白血病的发生发展相关。第二部分WNT5A与β-连环素蛋白异常表达的相关性研究目的:建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR方法检测白血病细胞株中β-连环素及WNT5AmRNA的表达。研究WNT5A基因与β-连环素蛋白异常表达的相关性。方法:在TRIzol提取总RNA后,将mRNA逆转录成cDNA,采用SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR的方法检测β-连环素和WNT5AmRNA在白血病细胞株和健康体检者外周血单个核细胞中的表达。扩增产物的特异性通过熔解曲线确认,选择GAPDH为内参,采用2-△△Ct法计算相对表达量。结果:(1)β-连环素mRNA在白血病细胞株(K562、HL-60、Jurkat、Thp-1)中均有表达,其中高表达β-连环素蛋白的Jurkat和Thp-1细胞株中β-连环素基因的转录水平比K562和HL-60细胞株的基因转录水平更低。(2)WNT5AmRNA在4种白血病细胞株中均有表达,其中高表达β-连环素蛋白的Jurkat和Thp-1细胞株中有较高的WNT5A mRNA的表达,与之相反,无β-连环素异常定位的K562和HL-60细胞株中WNT5AmRNA的表达水平低,正常外周血单个核细胞并不表达WNT5A mRNA。结论:(1)SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR是一种快速有效、灵敏度高、特异性好的定量检测方法。(2)β-连环素蛋白在Jurkat和Thp-1细胞中过量表达的机制并不是发生在转录水平,可能与WNT5AmRNA的高表达相关。第三部分利用RNAi技术特异沉默WNT5A基因对β-连环素表达的影响目的:参考相关文献以WNT5A cDNA序列的607-627bp处为靶点,选择psiRNA-hH1neo真核表达载体,构建psiRNA-WNT5A shRNA真核表达载体。转染入高表达WNT5AmRNA的Jurkat细胞株中,应用G418抗性筛选稳定转染细胞株,观察WNT5AmRNA在Jurkat细胞株中的下调及其对β-连环素转录水平、蛋白表达水平及定位的影响。方法:参考相关文献,使用Invivogen公司提供的在线软件,设计针对WNT5AmRNA的siRNA序列,人工合成一对互补并编码相应短发夹状RNA的寡核苷酸链。用DNA重组技术将针对WNT5AmRNA的siRNA序列克隆到真核表达载体psiRNA-hH1neo中,构建psiRNA-WNT5A表达载体。使用阳离子脂质体介导转染Jurkat细胞,经G418筛选后获得稳定的转染细胞株。实时荧光定量RT-PCR技术检测转染前后Jurkat细胞中WNT5AmRNA、β-连环素mRNA的变化。Western Blot检测β-连环素蛋白表达的变化,免疫细胞化学检测转染前后Jurkat细胞中β-连环素蛋白的定位变化。结果:(1)成功构建psiRNA-WNT5A真核表达载体,经酶切和质粒测序鉴定证明构建成功。(2)在Jurkat细胞中转染psiRNA-WNT5A,实时荧光定量RT-PCR方法检测WNT5AmRNA表达,证实psiRNA-WNT5A可以显著下调WNT5AmRNA的表达。(3)稳定转染psiRNA-WNT5A的Jurkat细胞中β-连环素基因水平无明显改变,β-连环素蛋白的表达下降,且蛋白在胞核中的表达随WNT5A基因的沉默而下降。结论:(1)成功构建真核表达载体psiRNA-WNT5A。(2)psiRNA-WNT5A能有效的抑制WNT5AmRNA在Jurkat细胞中的表达。(3)转染前后Jurkat细胞中β-连环素mRNA的表达水平无明显改变,提示WNT5A调控β-连环素的机制并不是发生在转录水平。(4)稳定转染psiRNA-WNT5A的Jurkat细胞中β-连环素蛋白的表达较转染前明显下调。提示WNT5A可能通过抑制β-连环素在胞浆内的降解而调控β-连环素蛋白的表达。(5)稳定转染psiRNA-WNT5A的Jurkat细胞中β-连环素蛋白在核内的表达较转染前明显下调。(6)稳定转染psiRNA-WNT5A的Jurkat细胞中WNT信号通路下游的重要靶基因c-myc、c-jun mRNA的表达降低。