帕金森病(Parkinson disease,PD)是全球第二大常见的神经系统退行性疾病,临床症状以静止性震颤和运动迟缓等运动障碍为主要表现,可伴有情绪障碍、认知障碍甚至痴呆等非运动症状。然而,到目前为止,帕金森病的确切病因及发病机制并不明确,而流行病学的调查显示环境因素对占绝大多数的散发型PD的发病具有重要影响。农药残余是环境化学污染物的重要来源之一,而且我国食品农药残留超标在检测中长期存在。近期多个媒体报道,存在11种农药残留超标的“毒豆角”竟然从来没有被检查过；美国的一项研究发现,在被调查人群中高达82%的人在尿液中检测到有机磷农药(organophosphate pesticide, OPs)毒死蜱(chlorpyrifos, CPF)的代谢产物。毒死蜱是目前全世界范围使用最广、用量最大的农药之一,是广泛用于家庭生活、农业生产及公共卫生项目中的一种杀虫剂和除草剂。因此研究毒死蜱对黑质致密部(substantia nigra compact, SNpc)多巴胺(Dopamine, DA)神经元的影响及其机制,有可能为揭示PD的病因及发病机制提供新的思路。本研究将从以下五个部分进行探索。第一部分：低剂量毒死蜱对体外多巴胺能SH-SY5Y细胞的毒性作用目的证实低剂量毒死蜱对多巴胺能神经元SH-SY5Y细胞的影响。方法在细胞对数生长期,对未分化的多巴胺能SH-SY5Y细胞进行毒死蜱处理(毒死蜱浓度分别为：10uM、30uM、50uM及80uM),设立溶媒二甲亚砜(dimethysulfoxide, DMSO)对照组(即浓度为：0uM)；用比色法测定细胞在暴露毒死蜱后24h、48h、72h及96hMTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide, MTT]水平,检查细胞的损伤程度和功能状况；流式细胞术定量地检测毒死蜱处理后96h凋亡细胞百分比；光镜下观察细胞形态的变化。结果5种不同浓度毒死蜱处理的多巴胺能SH-SY5Y细胞直到暴露后96h都没有发现明显的细胞凋亡；光镜下也没有发现明显的细胞形态学改变；然而,MTT实验发现：虽然暴露10μM浓度毒死蜱后96h并未观察到SH-SY5Y生长受到抑制(p>0.05),但在30μM、50μM、80μM毒死蜱浓度暴露后96h, SH-SY5Y生长受到了明显抑制(p<0.05),同时发现30μM、50μM和80μM毒死蜱处理组之间没有明显差异(p>0.05)。结论低剂量毒死蜱暴露多巴胺能SH-SY5Y细胞虽没有引起明显的细胞凋亡和形态学改变,但暴露浓度等于或高于30μM时细胞的增殖和活力会受到影响。第二部分：大鼠脑发育期暴露亚中毒阈剂量毒死蜱动物模型的建立目的建立大鼠脑发育期暴露亚中毒阈剂量毒死蜱动物模型。方法新生Sprague-Dawley (SD)大鼠,随机分为CPF组和对照组,对照组又分为DMSO组和生理盐水(normal sodium, NS)组。在大鼠出生后11-14d (postnatal day11-14, PND11-14)经腹部皮下注射亚中毒阈剂量(5mg/kg.d)毒死蜱,建立大鼠脑发育期暴露亚中毒阈剂量毒死蜱动物模型；将脂溶性的毒死蜱溶于溶媒DMSO中处理大鼠；对照组分别以DMSO、NS替代毒死蜱。每次给药后12h严密观察有无抽搐、急性有机磷农药中毒症状以及翻正反射改变情况；并在PND20、PND30和PND60三个时间点,观察大鼠体重增长、脑外观、脑系数和脑含水量变化。结果大鼠脑发育期暴露亚中毒阈剂量毒死蜱后未观察到急性有机磷农药中毒症状,观察至青春期(PND30)及成年期(PND60)均未发现其体重增长、脑外观、脑系数、脑含水量明显异常。结论SD大鼠脑发育期暴露亚中毒阈剂量毒死蜱动物模型建立成功,亚中毒阈剂量毒死蜱短期暴露易被认为是“安全的”,并容易被忽视。第三部分：亚中毒阈剂量毒死蜱大鼠脑发育期暴露对中脑黑质星型胶质细胞、小胶质细胞的活化及多巴胺能神经元动态的影响目的探索亚中毒阈剂量毒死蜱大鼠脑发育期暴露对中脑黑质星型胶质细胞、小胶质细胞的活化以及黑质多巴胺能神经元动态的影响。方法新生SD大鼠,随机分为CPF组和对照组(DMSO组、NS组),建立大鼠脑发育期暴露亚中毒阈剂量毒死蜱动物模型。在PND20、PND30和PND60用免疫组织化学方法检测大鼠中脑黑质多巴胺能神经元标记物酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase, TH)表达情况,通过免疫透射电镜观察黑质多巴胺能神经元亚细胞结构的变化；在毒死蜱暴露后12h、24h、72h以及PND30、PND60用免疫组织化学法半定量检测黑质星型胶质细胞特异性标志物胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acid protein, GFAP)和小胶质细胞标志物CDllb的表达的变化,通过免疫荧光双标法检测中脑黑质中TH分别与GFAP、CDllb的表达情况。结果①.大鼠脑发育期(PND11-14)暴露亚中毒阈剂量毒死蜱后,虽然在PND20时中脑黑质没有显著的多巴胺能神经元的丢失,但在青春期时(PND30) CPF组大鼠黑质多巴胺能神经元较对照组出现明显的丢失(p<0.05),并随着年龄的增长,到成年期时(PND60) CPF组大鼠黑质多巴胺能神经元呈进行性丢失趋势(p<0.05)。透射电镜观察到成年期CPF组大鼠黑质存活的部分多巴胺能神经元出现亚细胞结构改变。②.大鼠脑发育期暴露亚中毒阈剂量毒死蜱能迅速诱导黑质星型胶质细胞和小胶质细胞的大量激活,其中小胶质细胞激活早于星型胶质细胞,在暴露后12h就开始明显活化,但到青春期时就基本恢复静止状态；星型胶质细胞的明显活化比小胶质细胞的活化持久,一直到成年期。结论大鼠脑发育期暴露亚中毒阈剂量毒死蜱能迅速激活黑质小胶质细胞和星型胶质细胞,并诱导黑质多巴胺能神经元迟发性进行性损伤。第四部分：亚中毒阈剂量毒死蜱大鼠脑发育期暴露对中脑黑质p38MAPK、NFκBp65信号途径的影响目的探讨亚中毒阈剂量毒死蜱大鼠脑发育期暴露对中脑黑质部位重要的炎症信号途径p38MAPK、NFκB p65的影响。方法新生SD大鼠,随机分为CPF组、DMSO组和NS组,每组又分为毒死蜱暴露后12h、24h、72h三个亚组。建立大鼠脑发育期暴露亚中毒阈剂量毒死蜱动物模型。利用免疫组织化学方法观察中脑黑质磷酸化p38MAPK表达及核染情况,NFκB p65活化后核移位情况；并用Western-blotting法定量检测中脑黑质脑组织匀浆中p-p38MAPK、 P-NFκB p65和NFκB p65的表达水平。结果从毒死蜱暴露后12h开始,CPF组大鼠中脑黑质中可以观察到磷酸化p38MAPK阳性免疫复合物的大量表达,表达水平在三个时点均较对照组增高,棕黄色的核染颜色较对照组深,核染数目较对照组多,差异有显著统计学意义(p<0.05),并在毒死蜱暴露后24h即达到了表达高峰,并持续高表达到毒死蜱暴露后72h, Western-blotting法检测到黑质p-p38MAPK表达水平变化和免疫组化结果一致；同样可以观察到黑质NFκB p65的核移位表达增加,Western-blotting法检测发现P-NFκB p65表达上调(p<0.05),并在毒死蜱暴露后72h达到高峰,但不影响总的NFκBp65的表达(p>0.05)。结论大鼠脑发育期暴露亚中毒阈剂量毒死蜱能迅速导致炎症信号通路p38MAPK及NFκB p65信号途径的活化,黑质部位炎性环境可能参与了多巴胺能神经元的迟发进行性损伤。第五部分：大鼠脑发育期暴露亚中毒阈剂量毒死蜱对其青春期及成年期运动能力和学习记忆的影响目的探索亚中毒阈剂量毒死蜱大鼠脑发育期暴露对大鼠远期整体神经行为的影响。方法新生SD大鼠,随机分为CPF组、DMSO组和NS组。建立大鼠脑发育期暴露亚中毒阈剂量毒死蜱动物模型。在大鼠成长至青春期(PND30)及成年期(PND60)时,用空场实验、悬吊实验和斜坡实验评估大鼠主动运动功能和运动协调能力的变化,通过Mirros水迷宫法评价其空间学习和记忆提取能力的改变。结果旷场实验中青春期的各组大鼠垂直次数、修饰次数及大便颗粒数无显著差异(p>0.05),但CPF组大鼠移动总格数及中央格停留时间显著少于对照组(p<0.05),成年期CPF组大鼠的移动总格数和中央格停留时间进一步减少,垂直次数、修饰次数和大便颗粒数亦显著少于DMSO和NS组别(p<0.05),与青春期CPF组相比亦有显著性差异(p<0.05)；悬吊实验和斜坡实验中,青春期各组大鼠表现无差别,直到成年期才发现CPF组能抓住绳子维持的时间较对照组明显缩短、从斜坡上滑下次数较对照组明显增加(p<0.05)；Morris水迷宫实验中CPF组青春期大鼠在定位航行实验中到达平台的逃避潜伏期虽然长于同时期DMSO组和NS组,在空间探索实验中大鼠在目标象限停留距离稍缩短,但结果较对照组都无显著差异(p>0.05),到成年期时,CPF组大鼠到达平台的逃避潜伏期明显长于同时期对照组大鼠(p<0.05),且空间探索实验中发现CPF组大鼠的搜索轨迹多集中在原来的起始象限或相邻象限,且CPF组成年期大鼠在目标象限停留距离进一步缩短,并和对照组比较存在显著性差异(p<0.05)。结论亚中毒阈剂量毒死蜱大鼠脑发育期暴露能导致大鼠出生后远期整体行为的改变,主要表现为大鼠在青春期和成年期开始出现了主动运动能力、运动协调能力以及空间学习、记忆提取能力的损害,并且上述损害随着年龄的增加表现得更明显。