一、研究背景近年来已经对高密度脂蛋白(high density lipoprotein, HDL)蛋白质组分的含量及变化情况进行了研究。结果表明：冠心病(coronary heart disease, CHD)患者的HDL蛋白质组成发生变化,联合应用他汀类药物+烟酸后,CHD患者的HDL蛋白质组成趋向于“正常化”。不过,该领域的研究尚少,结果差异较大,验证性工作不足,有必要开展进一步的研究工作。本实验室前期应用蛋白质组学技术比较了CHD患者与非CHD患者(对照组)之间的HDL蛋白质组差异,发现与对照组相比,CHD组HDL中的载脂蛋白A-I(apolipoprotein A-Ⅰ, apoA-Ⅰ)水平显著下降,血清淀粉样蛋白A (serum amyloid A protein, SAA)水平显著升高,但是尚缺乏较大样本的验证性研究。目前国内外尚未报道单独应用他汀类药物治疗冠心病患者前后HDL蛋白质组的变化,且研究已显示他汀类药物可与HDL之间存在功能的相互作用,机制并不十分清楚。因此,本研究拟从两方面进行研究：①,验证上述实验室前期获得的结果,探讨HDL中SAA和apoA-Ⅰ蛋白水平的变化及与冠心病的关系;②,采用蛋白质组学技术比较他汀类药物使用前后HDL组分的变化,以探讨CHD患者在服用他汀类药物的调脂治疗过程中HDL蛋白组分是否有变化,这种变化是否与患者的疗效有关。同时也希望从另一角度即HDL组分的变化来探讨他汀类药物的作用机制。二、研究内容第一部分冠心病患者血浆HDL中apoA-Ⅰ与SAA组分变化的研究1.研究目的比较CHD患者与非CHD患者(对照组)血浆HDL中apoA-Ⅰ与SAA组分差异。2.研究方法2.1研究对象：2.1.1CHD组：至少有一支冠状动脉狭窄大于50%,未服用调脂药；2.1.2对照组：排除CHD,且年龄、性别与CHD组相匹配；2.2样品收集与HDL分离：收集空腹血浆,应用溴化钾超高速离心方法分离血浆中的HDL；2.3ELISA法检测血浆及其HDL中的apoA-Ⅰ和SAA的水平;2.4统计学分析：pearson相关性分析研究血浆及HDL中apoA-Ⅰ和SAA的相关性；logistic回归分析研究血浆及HDL中这两种蛋白与CHD的关联程度。3.研究结果3.1HDL中apoA-Ⅰ和SAA水平变化3.1.1CHD组(n=67)与对照组(n=67)相比,HDL-apoA-Ⅰ水平降低,差异有统计学意义(7.80±3.32g/mL vs.10.42±5.51g/mL,P=0.001)；校正可能的混杂因素后,其在两组间的显著性差异消失(B=-0.109,P=0.088)。3.1.2CHD组与对照组相比,log (HDL-SAA)显著升高,差异有统计学意义(1.39±0.58vs.1.15±0.46,P=0.011)；校正可能的混杂因素后,其在两组之间的差异仍有统计学意义(B=1.738,P=0.017),且log(HDL-SAA)每升高个单位,CHD的发生风险升高4.685倍(OR=5.685,95%CI：1.371,23.581)。3.2血浆中apoA-Ⅰ和SAA水平变化3.2.1CHD组(n=67)和对照组(n=67)相比,plasma-apoA-Ⅰ的差异无统计学意义(0.7±0.33g/mL vs.0.79±0.28g/mL,P=0.122)。3.2.2CHD组和对照组相比,log(plasma-SAA)水平升高,差异有统计学意义(1.13±0.54vs.0.88±0.48,P=0.005)；校正可能的混杂因素后,其在两组之间的差异仍有统计学意义(B=1.646,P=0.038),且log(plasma-SAA)每升高1个单位,CHD的发生风险升高4.185倍(OR=5.185,95%CI;1.095,24.544)。3.3pearson相关性分析：在对照组及CHD组的血浆及HDL中apoA-Ⅰ与SAA的相关系数均无统计学意义。4.第一部分研究结论4.1与对照组相比,CHD患者HDL蛋白质组成发生改变：SAA水平明显升高,apoA-Ⅰ有下降趋势。4.2血浆中apoA-Ⅰ在两组之间无明显差异;CHD组血浆SAA明显升高。提示HDL及血浆中SAA均为CHD的危险因素。第二部分冠心病患者服用他汀类药物后血浆HDL蛋白质组分变化的研究(一)冠心病患者服用他汀类药物前后血浆HDL蛋白质组成变化的比较1.研究目的探索CHD患者服用他汀类药物前后HDL蛋白质的组成及各组分水平的差异。2.研究方法2.1研究对象：2.1.1CHD组(n=9);至少有一支冠状动脉狭窄大于50%,入组时未服用他汀等调脂药,参加随访；2.1.2对照组(n=10)：排除CHD,且年龄、性别与CHD组相匹配；2.2样品的收集与分离：收集CHD组服用他汀类药物半年前后(药前组、药后组)及对照组的空腹血浆;溴化钾超高速离心法分离HDL样品；2.3iTRAQ-LC-MS技术：研究药前组、药后组及对照组之间HDL蛋白质组成及各组分水平的相对定量；2.4Gene Ontology (GO)功能分析：利用GO功能分析鉴定到的蛋白质分子功能、参与的生物过程及细胞组成分布的特点；2.5蛋白质聚类分析：三组之间HDL组分差异水平特点。3.研究结果3.1在药前组、药后组和对照组的HDL鉴定出196种高置信度的蛋白质组分。3.2GO分析发现这些蛋白具有多种分子活性,参与多种生物学过程。3.3聚类分析显示CHD患者服用他汀类药物前与对照组HDL蛋白水平之间的差异大于CHD患者药后与对照组HDL蛋白水平之间的差异。3.4CHD患者药前药后比较发现14种差异蛋白；在CHD组与对照组之间发现13种差异蛋白；其中serum amyloid A2isoform(SAA2)、complement C5preproprotein和histone H1.0三种蛋白的变化趋势均表现为在CHD组显著升高,服用他汀类药物后其在HDL中的含量显著下降,下降水平接近对照组。4.研究小结4.1在CHD药前、药后和对照组的HDL中共鉴定出196种高置信度的蛋白质组分；4.2GO分析发现这些蛋白具有多种分子活性,参与多种生物学过程；4.3聚类分析显示CHD患者服用他汀类药物前与对照组HDL蛋白水平之间的差异大于CHD患者药后与对照组HDL蛋白水平之间的差异。4.4CHD患者药前药后比较发现14种差异蛋白；在CHD组与对照组之间发现13种差异蛋白；其中serum amyloid A2isoform(SAA2)、complement C5preproprotein和histone H1.0三种蛋白的变化趋势均表现为在CHD组显著升高,服用他汀类药物后其在HDL中的含量显著下降,下降水平接近对照组(二)冠心病患者服用他汀类药物前后血浆HDL中SAA差异水平的变化1.研究目的比较CHD患者服用他汀类药物前后HDL中SAA的水平,初步验证iTRAQ-LC-MS中发现的候选差异蛋白SAA2的水平。2.研究方法2.1研究对象：2.1.1CHD组(n=44)；至少有一支冠状动脉狭窄大于50%,入组时未服用他汀等调脂药,参加随访；2.1.2对照组(n=45)：排除CHD,且年龄、性别与CHD患者相匹配；2.2样品的收集与分离：收集CHD组服用他汀类药物半年前后(药前组、药后组)及对照组的空腹血浆；溴化钾超高速离心法分离HDL样品；2.3ELISA法检测：CHD药前组与药后组HDL样品中SAA水平。3.研究结果与药前HDL中log(HDLSAA)的水平相比,CHD患者服用他汀类后HDL中的SAA水平明显下降(1.28±0.51vs.1.01±0.51,P=0.014),与iTRAQ结果一致。4.研究小结他汀类药物可显著下调HDL中SAA的水平。(三)服用他汀类药物与未服用他汀类药物的冠心病患者血浆HDL中SAA差异水平的研究1.研究目的比较服用他汀类药物半年的CHD患者与未服用他汀类药物的CHD患者血浆HDL中SAA的水平,再次验证iTRAQ-LC-MS中鉴定的候选差异蛋白SAA2水平。2.研究方法2.1研究对象：2.1.1CHD用药组(n=65)：至少有一支冠状动脉狭窄大于50%,入组时已经规律服用他汀类药物半年左右,未合并使用其他调脂药；2.1.2CHD未用药组(n=67)：至少有一支冠状动脉狭窄大于50%,未服用任何调脂药；2.2样品收集与HDL分离：收集空腹血浆：超高速离心分离HDL样品；2.3ELISA法检测：CHD用药组与CHD未用药组HDL样品中SAA水平；2.4统计学分析：利用协方差分析的方法校正两组之间的基线差异。3.研究结果3.1CHD用药组HDL中的log (HDL-SAA)水平与CHD未用药组相比,显著下降(1.34±0.58vs.1.04±0.46, P=0.0002)。3.2校正总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、apoA-Ⅰ、载脂蛋白B、肌酐、血糖及高敏C反应蛋白的水平差异后,log(HDL-SAA)在两组之间的差异仍有统计学意义(P=0.005)。3.3进一步校正HDL-C的水平,log(HDL-SAA)在两组之间的差异仍有统计学意义(P=0.015)。4.研究小结HDL中的SAA水平与CHD患者服用他汀类药物有关。三、结论1.CHD患者HDL蛋白质组成发生改变：其中SAA水平明显升高,apoA-Ⅰ有下降趋势。SAA为CHD的危险因素。iTRAQ技术又新发现CHD组与对照组之间有13种差异蛋白(6种在CHD组HDL中上调,7种下调)。2.CHD患者他汀药治疗后,SAA水平下降至正常水平,且不受其他因素影响。iTRAQ技术又新发现CHD组药后与药前HDL样品中有14种差异蛋白(10种在药后HDL中上调,4种下调)。3.他汀类调脂药可改变HDL中某些蛋白水平。4.HDL由多种蛋白质成分组成,可以从HDL蛋白组成研究HDL所具有的生物学功能。