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第一部分小胶质细胞P2Y12受体参与慢性偏头痛的中枢敏化目的慢性偏头痛(Chronic migraine,CM)的病理生理机制目前尚不明确,中枢敏化在该病的发病过程中起重要作用。小胶质细胞活化可诱导中枢敏化的形成,参与CM的发病。P2Y12受体是小胶质细胞表面的特异性受体,既往研究证实该受体参与慢性疼痛的发生与维持,但它是否同样介导CM的发病机制目前尚无报道。该研究将分析CM模型小鼠三叉神经脊束核(Trigeminal nucleus caudalis,TNC)中小胶质细胞P2Y12受体的表达情况,并明确该受体对CM中枢敏化的影响。方法1.反复腹腔注射硝酸甘油(Nitroglycerin,NTG)建立CM模型,即在第1、3、5、7、9天分别给予小鼠腹腔注射10mg/kg NTG,然后采用免疫印迹试验(Western blot,WB)分析对照组和NTG注射1、3、5、9天组中TNC部位P2Y12受体的蛋白表达情况。通过免疫荧光染色技术研究对照组和模型组(NTG 9d)中TNC部位P2Y12受体的形态特征及表达变化情况,并用免疫荧光双标染色技术将CM模型组TNC部位的P2Y12受体和神经元、小胶质细胞及星形胶质细胞进行细胞定位分析。2.给CM小鼠腹腔注射P2Y12受体拮抗剂MRS2395(1.5mg/kg)和氯吡格雷(15、45和100mg/kg),而后用电子测痛仪检测各组小鼠眶周和足底机械痛阈值的变化,采用辐射热测痛仪测量各组小鼠足底热痛阈值的变化。并通过WB和免疫荧光染色技术分析各组TNC部位降钙素基因相关肽(Calcitonin gene-related peptide,CGRP)蛋白释放量及c-fos表达量的变化。结果1.WB结果显示NTG反复注射过程中TNC部位P2Y12受体蛋白水平较对照组逐渐增加,在NTG注射第5d和9d上调趋势明显(p<0.01)。免疫荧光染色结果表明模型组TNC部位P2Y12受体的细胞数及免疫荧光强度均明显上调(p<0.05)。免疫荧光双标结果展示TNC部位P2Y12受体仅和小胶质细胞共表达。2.行为学检测结果表明NTG注射后小鼠眶周和足底机械痛阈值、热痛阈值明显下降(p<0.05),MRS2395和氯吡格雷干预后眶周和足底机械痛阈值、热痛阈值较模型组明显增加(p<0.05)。WB结果展示NTG第5d注射后TNC部位CGRP蛋白量较对照组明显上调(p<0.05),一直持续9d,MRS2395及氯吡格雷干预后CGRP水平较模型组明显下降(p<0.05)。免疫荧光染色结果展示CGRP在TNC部位呈絮状分布,NTG模型组CGRP荧光强度较对照组明显增加(p<0.05),MRS2395及氯吡格雷干预组免疫荧光强度较模型组明显减弱(p<0.05)。同样,WB及免疫荧光染色发现模型组TNC部位c-fos蛋白水平及细胞数目较对照组明显增加(p<0.05),拮抗剂干预后其蛋白水平和细胞计数较模型组明显减少(p<0.05)。结论该部分研究结果发现CM模型中TNC部位小胶质细胞P2Y12受体的表达上调,予该受体拮抗剂MRS2395及氯吡格雷抑制其功能后缓解了痛觉过敏行为,并减少了TNC部位CGRP和c-fos的表达,表明P2Y12受体参与CM的中枢敏化。该研究结果提示P2Y12受体可能是CM临床治疗的新靶点,氯吡格雷作为临床常用的P2Y12受体拮抗剂可能对CM的治疗有效。第二部分P2Y12受体介导小胶质细胞形态改变及炎性介质的释放目的小胶质细胞活化后发生形态改变,释放多种促炎因子,并能增强其吞噬和迁移能力,参与中枢敏化,介导疼痛的发生与维持。P2Y12受体作为小胶质细胞表面的特异性受体,可参与调控小胶质细胞活性改变,但它对CM中枢敏化的影响是否和调控小胶质细胞功能相关,目前尚无报道。本研究在CM动物模型中分析P2Y12受体对TNC部位小胶质细胞形态及炎性介质释放情况的影响,并在体外BV-2细胞中予以验证,以明确P2Y12受体是否通过介导小胶质细胞活化参与CM的中枢敏化。方法1.免疫荧光染色技术分析CM组及各干预组中TNC部位小胶质细胞数量及形态的改变,WB技术分析TNC中白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)和诱导型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase,i NOS)的蛋白水平变化。2.脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)(1μg/ml)刺激BV-2细胞诱导其向M1型激活态转变,模拟CM中TNC部位小胶质细胞激活。WB技术分析LPS刺激过程中BV-2细胞P2Y12受体、i NOS的表达,酶联免疫吸附测定(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)方法检测LPS刺激的BV-2细胞释放IL-1β和TNF-α的水平,免疫荧光双标技术分析P2Y12受体和BV-2细胞的定位情况。给予MRS2395(20μM)和氯吡格雷(0.18μM,1.8μM)干预BV-2细胞,而后用免疫荧光染色技术分析各组BV-2细胞形态的转变,WB及免疫荧光染色技术分析各组i NOS的表达情况,ELISA法检测各组细胞IL-1β和TNF-α的释放水平变化。结果1.免疫荧光染色结果显示NTG模型组中TNC部位的小胶质细胞数量及免疫荧光强度明显增加(p<0.05),小胶质细胞胞体变大变圆,突起总长度及平均长度较对照组明显缩短(p<0.05),MRS2395及氯吡格雷干预后小胶质细胞数量及免疫荧光强度较NTG组无明显变化,但其突起总长度及平均长度较NTG组明显延长(p<0.05)。NTG刺激后TNC部位i NOS、IL-1β和TNF-α的蛋白表达水平上调(p<0.05),MRS2395和氯吡格雷干预组的i NOS、IL-1β和TNF-α水平较NTG组明显下降(p<0.05)。2.LPS刺激8h后P2Y12受体、i NOS蛋白水平开始增高(p<0.05),持续24h,ELISA结果表明LPS刺激24h后IL-1β释放水平上调(p<0.05),TNF-α水平在LPS刺激8h时开始增加(p<0.05),持续24h。免疫荧光染色证实P2Y12受体与BV-2细胞共表达。LPS刺激24h后BV-2细胞变大变圆,i NOS免疫荧光强度增加,MRS2395和氯吡格雷干预后i NOS表达下调(p<0.05),且免疫荧光强度减弱,ELISA测得IL-1β和TNF-α的释放水平较LPS组明显减少(p<0.05)。仅MRS2395干预后LPS诱导的BV-2细胞向长梭形改变,氯吡格雷对BV-2细胞形态改变无明显影响。结论该部分研究发现CM小鼠TNC部位的小胶质细胞数量增多,胞体变大、突起缩短,炎性介质释放增多,说明小胶质细胞向M1型激活态转变。P2Y12受体功能受抑制后小胶质细胞突起延长,炎性介质释放减少,阻碍了小胶质细胞的活化。这些结果表明P2Y12受体是通过介导小胶质细胞活化参与CM的中枢敏化。第三部分P2Y12受体通过Rho A/ROCK信号通路介导小胶质细胞活化参与慢性偏头痛的中枢敏化目的Rho A/Rho-associated coiled coil-containing kinase(ROCK)信号通路参与疼痛的发生发展,P2Y12受体可通过该信号通路影响细胞形态的变化及炎性介质的释放。本研究分析CM模型中Rho A和ROCK2的表达,及其功能受抑制后痛觉过敏行为、CGRP释放水平的变化,以明确Rho A/ROCK信号通路是否参与CM的中枢敏化。抑制P2Y12受体功能后分析Rho A和ROCK2的表达,并研究Rho A/ROCK信号通路对小胶质细胞活性的影响,明确P2Y12受体是通过Rho A/ROCK信号通路介导小胶质细胞活化参与CM的中枢敏化。方法1.WB方法分析NTG注射后1、3、5、9d的TNC部位GTP-Rho A和ROCK2蛋白水平的变化。ROCK抑制剂法舒地尔(30mg/kg)腹腔注射后分别用电子测痛仪和热辐射测痛仪检测各组小鼠的眶周、足底机械痛阈值和热痛阈值的变化,WB及免疫荧光染色技术分析TNC部位CGRP蛋白水平及免疫荧光强度的变化。2.WB技术分析P2Y12受体拮抗剂MRS2395和氯吡格雷干预后GTP-Rho A和ROCK2的表达水平变化,法舒地尔干预后P2Y12受体、GTP-Rho A和ROCK2的表达变化。3.免疫荧光染色技术分析法舒地尔干预后各组小胶质细胞数目及形态的变化,WB技术分析各组IL-1β、TNF-α和i NOS的蛋白水平变化。结果1.WB结果展示NTG注射9d后GTP-Rho A和ROCK2的表达上调(p<0.05)。痛阈检测结果表明法舒地尔干预后小鼠的眶周和足底痛阈值较NTG组明显增加(p<0.05),热痛阈潜伏期较NTG组明显延长(p<0.05)。WB及免疫荧光染色结果均显示法舒地尔干预后TNC部位CGRP蛋白量及免疫荧光染色强度较NTG组明显下降(p<0.05)。2.MRS2395和氯吡格雷干预后GTP-Rho A和ROCK2的表达水平较NTG组明显下调(p<0.05),法舒地尔干预后GTP-Rho A和ROCK2的表达下降(p<0.05),但P2Y12受体的蛋白水平无明显变化。3.法舒地尔干预后对TNC部位小胶质细胞数目及免疫荧光强度无明显影响,但小胶质细胞突触总长度及平均长度较NTG组明显延长(p<0.05)。WB结果显示法舒地尔干预组TNC部位IL-1β、TNF-α和i NOS的表达水平较NTG组明显下调(p<0.05)。结论 该部分研究结果表明Rho A/ROCK信号通路活性被抑制后可缓解CM小鼠的痛觉过敏,抑制TNC部位CGRP的表达,提示该通路参与CM的中枢敏化。Rho A/ROCK信号通路作为P2Y12受体的下游通路,其功能被抑制后能影响小胶质细胞形态改变及炎性介质的释放,表明P2Y12受体是通过Rho A/ROCK信号通路影响了小胶质细胞的活化,从而介导CM中枢敏化的发生发展。