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目的:脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)后损伤部位会产生剧烈的炎症反应,导致损伤的进一步加重。大量文献报道核转录因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)信号通路和NLRP3炎症小体的激活对炎症反应的启动发挥关键作用。小胶质细胞是中枢神经系统的免疫细胞,脊髓中的神经炎症反应主要由小胶质细胞调控。松果菊苷(Echinacoside,ECH)是一种多酚类小分子化合物,被报道有显著的抗炎效应和神经保护作用,但是很少有文献报道松果菊苷在脊髓损伤中的作用。本研究的主要目的是:1)借助永生化的小胶质细胞系BV-2细胞在体外环境中探究松果菊苷对BV-2细胞活化和NF-κB信号通路的影响;2)体外环境中探究松果菊苷对BV-2细胞NLRP3炎症小体激活的影响及作用机制;3)制备大鼠脊髓损伤模型,在体内环境中探究松果菊苷能否减轻大鼠脊髓损伤,以及其中的作用机制。方法:1)利用细胞增殖活性检测试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)检测不同浓度的松果菊苷对BV-2细胞增殖活性的影响,确定合适的药物干预浓度进行后续实验。实验分为五个组:对照组,模型组,低、中、高剂量松果菊苷组。利用1μg/ml脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)处理BV-2细胞来制备炎症损伤模型。相差显微镜观察松果菊苷对BV-2细胞形态的影响。酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)测定各组细胞培养基中炎症因子IL-1β和IL-18的分泌。蛋白免疫印迹(Western blot,WB)检测各组细胞裂解物中p-NF-κB、p-IκBα和iNOS的表达水平变化,分析松果菊苷对BV-2细胞活化和NF-κB信号通路的影响;2)实验分为五个组:对照组,模型组,低、中、高剂量松果菊苷组。NLRP3炎症小体激活模型的制备是分别利用500ng/ml的LPS和1mM的三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)处理BV-2细胞。ELISA测定各组BV-2细胞培养基中炎症因子IL-1β和IL-18的含量。WB检测各组细胞裂解物中NLRP3炎症小体相关成分NLRP3、ASC、NEK7和Caspase-1表达水平变化,分析松果菊苷对NLRP3炎症小体激活的影响。WB检测各组p-NF-κB、NF-κB、p-Iκ-Bα和Iκ-Bα的表达水平变化,分析松果菊苷对NF-κB信号通路的影响;利用免疫荧光标记法进一步检测各组BV-2细胞中NLRP3的表达。Mito-tracker Red标记线粒体,共聚焦显微镜观察并采集图像,利用细胞内线粒体膜电位变化评估线粒体损伤状况;利用荧光探针DCFH-DA标记细胞,借助流式细胞学技术检测ROS的产生,评估松果菊苷对ROS产生的影响;3)将SD大鼠随机分为三个组:假手术组(Sham组);脊髓损伤组(SCI组);脊髓损伤+松果菊苷组(SCI+ECH组)。利用改良的Allen’s法制备大鼠脊髓损伤模型。测定各组大鼠在手术后第三天的脊髓含水量,利用BBB评分法和斜板试验观察各组大鼠运动功能变化,Nissl染色观察脊髓前角运动神经元状态,苏木素-伊红(Hematoxylin-Eosin,HE)染色观察各组大鼠脊髓组织病理形态学变化,明确松果菊苷对大鼠行为学和脊髓组织病理学变化的影响,借助ELISA技术检测各组炎症因子IL-1β和IL-18的表达水平,借助WB技术检测各组大鼠脊髓组织NLRP3、ASC、Caspase-1、NEK7等NLRP3炎症小体相关蛋白和NF-κB信号通路相关蛋白的表达水平。此外,本研究还借助WB检测了中性粒细胞标记物髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)和小胶质细胞标记物Iba-1的表达变化,来评估松果菊苷对脊髓组织中性粒细胞渗出和小胶质细胞增殖的影响。结果:1)CCK-8结果显示,松果菊苷在≤50μg/ml的浓度范围内对BV-2细胞增殖活性没有显著影响,因此,在后续的研究中选择10,20,50μg/ml的松果菊苷干预细胞。正常条件下培养的BV-2细胞处于静息态,LPS处理后的BV-2细胞胞体变大、周围突起减少,呈M1型活化状态。ELISA结果显示,LPS处理BV-2细胞后,IL-1β和IL-18的表达水平较对照组显著升高,而松果菊苷的应用能够减少IL-1β和IL-18的表达(P<0.01)。WB结果显示模型组p-NF-κB和p-IκBα的表达水平较对照组显著升高,10,20,50μg/ml三种剂量的松果菊苷均能降低p-NF-κB和p-IκBα的表达(P<0.01),并且存在剂量-效应关系。此外,松果菊苷能够降低BV-2细胞iNOS表达水平,抑制其向M1型细胞活化;2)WB结果显示,LPS+ATP处理BV-2细胞后,IL-1β和IL-18的表达水平较对照组显著升高,而松果菊苷的使用能够降低IL-1β和IL-18的表达(P<0.01)。模型组BV-2细胞的NLRP3、Caspase-1、ASC和NEK7表达水平较对照组细胞显著升高(P<0.01),表明NLRP3炎症小体被激活。在应用松果菊苷处理细胞后,能够显著降低NLRP3炎症小体相关蛋白的表达水平(P<0.01),并且存在剂量-效应关系。模型组p-NF-κB/NF-κB和p-Iκ-Bα/Iκ-Bα较对照组细胞升高,松果菊苷处理组p-NF-κB/NF-κB和p-Iκ-Bα/Iκ-Bα显著低于模型组(P<0.01)。此外,松果菊苷还能抑制ROS的产生,改善线粒体膜电位;3)BBB评分结果显示,SCI组和SCI+ECH组大鼠在手术后评分为0,表明成功制备了脊髓损伤模型。从术后第三天开始,SCI+ECH组大鼠的BBB评分和斜板角度都高于SCI组大鼠(P<0.05),脊髓组织病理学改变也较轻。此外,松果菊苷的应用能显著改善脊髓组织水肿(P<0.05),增加存活神经元细胞数目(P<0.05)并改善神经元细胞状态。ELISA结果显示松果菊苷的应用能够显著降低炎症因子IL-1β和IL-18的表达(P<0.01)。WB结果显示SCI+ECH组大鼠脊髓组织NLRP3炎症小体和NF-κB信号通路主要蛋白表达水平显著低于SCI组大鼠(P<0.01),中性粒细胞渗出和小胶质细胞增殖水平也低于SCI组大鼠(P<0.01)。结论:1)松果菊苷不仅能够抑制BV-2细胞向M1型细胞活化,而且能抑制NF-κB信号通路,减轻LPS诱导的BV-2细胞炎症反应;2)松果菊苷能够通过减轻线粒体损伤,减少ROS的产生,并抑制NF-κB信号通路,从而抑制BV-2细胞中NLRP3炎症小体的激活;3)松果菊苷能够通过调控NF-κB/NLRP3信号通路抑制NLRP3炎症小体的激活,减轻脊髓损伤后的神经炎症反应。此外,松果菊苷还能够改善脊髓水肿、抑制小胶质细胞的活化和中性粒细胞的渗出,从而改善脊髓损伤后的神经运动功能。