背景/目的:构建含有增强型青色荧光蛋白(ECFP)-尿激酶型纤溶酶原激活物(u PA)作用底物(substrate)-黄色荧光蛋白变体(YPet)的真核表达载体(ECFP-u PA substrate-linker-YPet),即uPA的生物传感器(uPAbiosensor)。方法:以现有质粒Src-biosensor为模板,Primer 5.0软件设计YPet引物,设计时5’端引入u PA底物序列及Linker,两端连接酶切位点及保护碱基。以p MDTM-18T为中间载体,通过基因工程方法构建含有ECFP-u PA substrate-linker-YPet的真核表达载体。并进行PCR,双酶切和测序鉴定,然后转染293T细胞,24h后在荧光显微镜下观察转染效率和融合蛋白表达情况,并用重组人u PA(rhu PA)刺激转染细胞,应用Meta Flour FRET 4.6软件观察并测量u PA生物传感器荧光共振能量转移(FRET)。结果:经过PCR和双酶切鉴定,克隆片段和酶切片段均与u PA substrate分子大小相符;将u PA biosensor转染入293T细胞中,转染效率达40%,并在FRET通道观察到了FRET现象,说明u PA biosensor融合蛋白在活细胞中得到表达,并且用免疫组化方法证明了u PA biosensor的膜表达;rhu PA刺激转染细胞可以检测到FRET现象变化,即在活细胞中证明了u PA biosensor构建成功。结论:u PA生物传感器已经构建成功,该生物传感器能够作为活细胞分子探针研究u PA的时空变化。