研究背景 子宫颈癌是严重威胁全球女性健康的恶性肿瘤之一,其发病率居女性恶性肿瘤的第四位。子宫颈转化区内高危型人乳头瘤病毒(High-Risk Human Papillomavirus,HR-HPV)持续性感染是导致子宫颈癌前病变及子宫颈癌的主要致病因素。在大多数子宫颈癌发生发展的过程中,存在着较长而且可逆转的癌前病变期。及时恰当的处理高危型HPV持续感染及子宫颈癌前病变,是防治子宫颈癌的根本所在。但目前临床上仍缺乏有效的清除HPV感染的手段,对于子宫颈鳞状上皮内病变(Cervical squamous intraepithelial lesions,SIL)和高危型HPV持续性感染的治疗主要是物理治疗和手术治疗。然而,物理治疗复发率较高;手术治疗(宫颈环形电切、冷刀锥切)又存在着出血、宫颈管狭窄、宫颈机能不全等不同程度影响生育功能的并发症。鉴于目前我国罹患宫颈病变的群体趋于年轻化,其中部分患者未婚或未产,强烈要求保留生理、生育功能,迫切需要一种既可以有效治疗子宫颈癌前病变、清除HPV感染又不影响宫颈机能的治疗方法。光动力学疗法(Photodynamic therapy,PDT)是临床医学、光学及光电子学等学科交叉融合而发展起来的一种新的治疗技术。PDT能选择性杀伤增生活跃的病变细胞,对正常细胞的毒性作用极小或无,可消灭隐性病灶,并能保留器官的完整性。此外,光动力学治疗还可与其他传统疗法如化疗、手术等相结合,具有协同作用,重复性好。PDT治疗肿瘤和HPV感染相关性疾病如尖锐湿疣、高危型HPV持续性感染、甚至早期子宫颈癌的临床疗效己得到肯定,但其疗效不一。深入研究PDT介导的细胞损伤的分子机制有助于提高PDT的治疗效果,对指导PDT在临床中的应用是非常必要的,也是PDT治疗最终走向临床的重要前提。Demyanenko等利用蛋白质微阵列芯片技术筛选与表观遗传学有关的差异表达蛋白质中发现:ALA-PDT作用后可引起组蛋白乙酰转移酶(Histone deacetylases,HDAC)-1和HDAC-11的表达上调。视网膜母细胞瘤结合蛋白48(Retinoblastoma associated protein 48,RbAP48),是组蛋白乙酰转移酶复合物中的高丰度蛋白组分。RbAp48,能协同其他蛋白调节组蛋白及其核小体相关的组蛋白乙酰转移酶复合物的构型和活性,从而抑制E2F调控基因的转录调节。研究己证实RbAp48是一种调控HPV16阳性子宫颈癌转化活性的重要蛋白,在HPV阳性的宫颈癌细胞系中过表达RbAp48能够抑制细胞的生长增殖及肿瘤形成,其机制与RbAp48调节抑癌基因p53、Rb以及Rb/E2F靶位基因和HPV E6、E7基因的表达有关。同时RbAP48也是一种放射敏感蛋白,其过表达能增加子宫颈癌细胞对放射治疗的敏感性,提示RbAp48可以作为一种HPV相关疾病的治疗靶位用于临床应用。本课题拟系统研究ALA-PDT对子宫颈鳞状上皮内病变及子宫颈癌的作用,以及RbAp48参与调控ALA-PDT对H8细胞及子宫颈癌细胞的作用及其机制,具体研究内容分为以下三个部分。第一部分ALA-PDT对H8细胞增殖和凋亡的影响及其机制研究背景和目的 高危型HPV尤其是HPV16、18亚型,在子宫颈粘膜的持续感染与子宫颈癌的发生密切相关。H8细胞是取材于我国正常妇女子宫颈磷柱上皮交界处的鳞状上皮,经体外转染HPV16 E6和E7基因而达到永生化的细胞株。该细胞株是一种理想的癌前病变模型细胞。本课题采用H8细胞为靶细胞,研究ALA-PDT对HPV感染细胞的增殖和凋亡的作用,探讨其清除子宫颈上皮HPV感染的机制。研究方法1.通过CCK-8实验和细胞计数实验检测ALA-PDT对H8细胞的增殖活性的影响;2.采用流式细胞术分析ALA-PDT对H8细胞周期及凋亡的影响;3.采用Western blot检测ALA-PDT作用于H8细胞后对凋亡相关基因p53和p21蛋白的影响;4.采用Real-time PCR检测ALA-PDT作用于H8细胞后对肿瘤相关基因、凋亡相关因子及HPV致癌基因E6、E7的mRNA的表达影响;5.采用Real-time PCR和Western blot检测ALA-PDT作用于H8细胞后对RbAp48的表达影响。结果1.ALA-PDT抑制H8细胞增殖 CCK-8实验和细胞计数实验结果表明:ALA-PDT对H8细胞有显著增殖抑制作用,且该抑制作用随着ALA浓度的增加而增强,呈剂量依赖性。而单独使用光敏剂ALA孵育H8细胞30小时,与对照组(0μM ALA-PDT)细胞比较,细胞活力几乎没有抑制作用。 2.ALA-PDT对H8细胞周期分布的影响细胞周期分析结果表明:不同浓度的ALA-PDT组G0/G|期的比率增多,S和G2/M期的比率明显减少,差异有统计学意义,且呈现出明显的剂量依赖性。3.ALA-PDT能诱导H8细胞凋亡流式细胞仪检测结果表明:不同浓度的ALA-PDT作用后24小时可显著诱导H8细胞的凋亡,且呈现出明显的剂量依赖关系。Western blot结果表明:ALA-PDT作用于H8细胞后24小时引起凋亡相关转录因子p53蛋白的表达量显著增加,同时伴有其下游靶基因p21蛋白的表达增加。4.ALA-PDT能促进H8细胞抑癌基因及凋亡相关因子的表达Real-time PCR结果显示:ALA-PDT能够促进抑癌基因(p53、p21、Rb),凋亡相关因子Caspase-3的mRNA表达。5.ALA-PDT能抑制H8细胞HPV E6、E7基因的表达Real-time PCR结果显示:ALA-PDT能够明显抑制HPV E6、E7的mRNA表达,其中150μM的ALA-PDT组最明显,大约是对照组E6的1/4,E7的1/2,差异有统计学意义。6.ALA-PDT能促进H8细胞RbAp48的表达ALA-PDT作用于H8细胞后,RbAp48的表达在mRNA和蛋白水平均显著升高。结论1.ALA-PDT对HPV16转化的人宫颈上皮永生化细胞系H8细胞有显著的增殖抑制和诱导凋亡效应,证明ALA-PDT是子宫颈鳞状上皮内病变的有效治疗方法。2.ALA-PDT作用于H8细胞,诱导p53和p21表达增加,将细胞周期阻滞于G()/G1期,可能为其诱导细胞凋亡的机制之一;ALA-PDT导致HPV16病毒癌蛋白E6和E7mRNA表达下调及RbAp48的表达上调,有助于清除HPV感染。第二部分RbAp48在ALA-PDT作用于H8细胞中的作用及其机制研究背景和目的既往研究表明RbAP48是调控HPV16阳性的子宫颈癌转化活性的重要蛋白,能抑制宫颈癌细胞的生长,降低HPV病毒的致瘤性,RbAp48可以作为一种HPV感染相关疾病的治疗靶位应用于临床。所以这一部分主要研究RbAp48在ALA-PDT杀伤H8细胞中所发挥的作用及其机制。研究方法1.采用免疫组织化学染色法在15例HSIL、21例LSIL的子宫颈病变组织和25例正常对照的子宫颈组织中检测RbAp48的表达差异;2.构建RbAp48siRNA,转染H8细胞并检测其干扰效率;通过CCK-8和细胞计数实验观察干扰RbAp48的表达后,ALA-PDT对H8细胞抗增殖效应的影响。3.采用流式细胞术检测siRbAp48组细胞和NC组细胞在接受1 OOhM ALA-PDT前后细胞周期和细胞凋亡的变化;4.采用Real-time PCR方法检测siRbAp48组细胞和NC组细胞分别接受100μM ALA-PDT前后肿瘤相关基因(p53、p21、Rb),凋亡相关因子Caspase-3及HPV E6、E7的mRNA表达变化。结果1.RbAp48在子宫颈鳞状上皮内病变组织及正常子宫颈鳞状上皮组织中的差异表达免疫组织化学染色结果显示:RbAp48在子宫颈鳞状上皮内病变组织及正常宫颈鳞状上皮组织中的细胞核中表达。RbAp48在HSIL中的高表达率显著低于正常子宫颈组织,差异有统计学意义。2.干扰RbAp48的表达能抑制ALA-PDT对H8细胞的增殖抑制作用构建RbAp48siRNA,转染H8细胞并检测其干扰效率。CCK-8和细胞计数实验结果表明:siRbAp48联合ALA-PDT组细胞的增殖活性明显高于NC联合ALA-PDT组的细胞。由此可见,抑制RbAp48表达后可降低ALA-PDT对H8细胞增殖的抑制效应。说明ALA-PDT对H8细胞的抗增殖效应,至少部分是由于ALA-PDT诱导细胞内RbAp48的表达升高所致。3.干扰RbAp48的表达能降低ALA-PDT诱导H8细胞凋亡的作用流式细胞分析结果显示:siRbAp48组的H8细胞经ALA-PDT处理后,细胞的总凋亡比例要显著低于ALA-PDT处理后的NC组细胞。这说明抑制RbAp48的表达能抑制ALA-PDT所致的细胞凋亡。4.细胞周期分析RbAp48对ALA-PDT作用于H8细胞的影响流式细胞分析结果显示:siRbAp48组的H8细胞中,ALA-PDT处理后G0/G1期的细胞比例要明显低于ALA-PDT处理后的NC组细胞。说明RbAp48表达的降低能抑制ALA-PDT所引起的Go/G1期的阻滞。5.ALA-PDT作用于H8细胞后,RbAp48对肿瘤基因p53、p21、Rb及凋亡相关因子Caspase-3的影响Real-time PCR结果同样显示:经ALA-PDT作用后,siRbAp48组细胞p53、p21、Rb和Caspase-3的mRNA表达水平显著低于NC组细胞。干扰RbAp48的表达后,ALA-PDT促进p53、p21、Rb和Caspase-3的mRNA表达受到抑制。6.ALA-PDT治疗后,RbAp48对HPV相关基因的影响Real-time PCR 结果显示:经 ALA-PDT 作用后,siRbAp48 组细胞 HPV E6、E7mRNA表达水平显著高于NC组细胞。说明干扰RbAp48的表达后,ALA-PDT引起的HPV E6、E7的mRNA表达降低明显受到抑制。结论1.ALA-PDT对HPV16转化的人宫颈上皮永生化细胞系H8细胞有显著的增殖抑制和诱导凋亡效应,干扰RbAp48的表达则抑制这一过程,证明RbAp48参与调控ALA-PDT对H8细胞的作用过程。2.RbAp48主要通过阻滞细胞周期、诱导凋亡、促进抑癌基因、抑制HPVE6、E7mRNA的表达来参与并影响ALA-PDT对H8细胞的作用过程。第三部分RbAp48在ALA-PDT作用于子宫颈癌细胞中的作用及其机制研究背景及目的 上述研究表明RbAp48参与了调控ALA-PDT对子宫颈鳞状上皮内病变的作用过程,在本部分的研究中,我们进一步以子宫颈癌细胞系SiHa细胞和HeLa细胞为例,采用一系列的实验方法验证RbAp48在ALA-PDT在治疗宫颈癌中所发挥的作用及其机制。研究方法1.采用Real-time PCR和Western blot分别从mRNA和蛋白水平上检测子宫颈癌细胞SiHa、Hela细胞在不同浓度的ALA-PDT作用后RbAp48的表达变化;2.构建RbAp48siRNA,转染子宫颈癌细胞系SiHa细胞和HeLa细胞并检测其干扰效率,通过CCK-8和细胞计数实验观察干扰RbAp48的表达后,ALA-PDT对子宫颈癌细胞抗增殖效应的影响;3.采用流式细胞术检测siRbAp48组细胞和NC组细胞分别接受100μM ALA-PDT前后细胞凋亡的变化;4.采用Real-time PCR方法检测siRbAp48组细胞和NC组细胞分别接受100μM ALA-PDT和对照处理后肿瘤相关基因(p53、p21、Rb),凋亡相关因子Caspase-3及HPV E6、E7的mRNA表达变化。结果1.RbAp48在ALA-PDT作用后子宫颈癌细胞中的表达差异Real-time PCR和Western blot结果表明:不同浓度的ALA-PDT作用于SiHa、HeLa细胞后,RbAp48的表达在mRNA和蛋白水平均显著升高。2.干扰RbAp48的表达能抑制ALA-PDT对子宫颈癌的增殖抑制作用构建RbAp48siRNA,转染子宫颈癌细胞系SiHa细胞和HeLa细胞并检测其干扰效率,其中siRbAp48(2)能更有效的抑制RbAp48的mRNA和蛋白水平的表达。因此,我们选取了 siRbAp48(2)进行后续的实验。CCK-8和细胞计数实验结果表明:siRbAp48联合ALA-PDT干扰处理组的细胞增殖活性显著高于NC联合ALA-PDT处理组细胞。由此可见,抑制RbAp48表达后可降低ALA-PDT对H8细胞增殖生长的抑制效应,说明ALA-PDT对子宫颈癌细胞增殖抑制效应,至少部分是由于ALA-PDT诱导细胞内RbAp48的表达升高所致。3.干扰RbAp48的表达能降低ALA-PDT诱导子宫颈癌细胞凋亡的作用流式细胞分析结果显示:siRbAp48组细胞经ALA-PDT处理后细胞凋亡的比例要显著低于ALA-PDT处理后的NC组细胞。也就是说RbAp48表达的降低能抑制ALA-PDT作用于子宫颈癌细胞所引起的细胞凋亡。4.ALA-PDT作用于子宫颈癌细胞后,RbAp48对肿瘤基因p53、p21、Rb及凋亡相关因子Caspase-3的影响Real-time PCR结果显示:经ALA-PDT作用后,siRbAp48组子宫颈癌细胞抑癌基因p53、p21、Rb和凋亡相关因子Caspase-3的mRNA表达水平显著低于NC组细胞。表明干扰RbAp48的表达后,ALA-PDT促进p53、p21、Rb和Caspase-3的mRNA表达增加受到抑制。5.ALA-PDT治疗后,RbAp48对HPV相关基因的影响Real-time PCR结果显示:经ALA-PDT作用后,siRbAp48组子宫颈癌细胞HPV E6、E7的mRNA表达水平显著高于NC组细胞。表明干扰RbAp48的表达后,ALA-PDT引起的HPV E6、E7的mRNA表达降低明显受到抑制。结论1.ALA-PDT对子宫颈癌细胞SiHa和HeLa细胞有显著的增殖抑制和诱导凋亡效应,干扰RbAp48的表达则抑制这一过程,证明RbAp48参与调控ALA-PDT对子宫颈癌细胞的作用过程。2.RbAp48主要通过阻滞细胞周期、诱导凋亡、抑制HPVE6、E7mRNA的表达来参与并影响ALA-PDT对SiHa和HeLa细胞的作用过程。