随着基因组学和蛋白质组学的快速发展,数据库中的序列正在呈指数增长,同时,分子生物学技术包括分子克隆与异源表达也取得了前所未有的进展。在本文中,我们对蛋白和多肽异源表达相关技术做了改进和创新,包括载体构建、异源蛋白或多肽的表达和纯化、全基因合成等几个方面,为高通量的蛋白和多肽结构功能关系的分析以及进一步应用打下了基础。我们建立了一种长引物和PCR介导的无缝克隆方法,命名为MP(mega primer)克隆,可以用于DNA片段插入以及多个片段的拼接。MP克隆包括两轮PCR,在第一轮PCR中扩增目的片段,在第二轮PCR中以长片段作为引物以指数的方式扩增质粒全长,PCR产物经过DpnI消化之后,即可转化到大肠杆菌感受态中。该方法除了操作简单效率高之外,成本也很低,不需要昂贵的重组酶、T4 DNA聚合酶或者IIS型内切酶等。MP克隆用于载体的构建,是一个非常有效的工具。利用无缝克隆技术,我们成功构建了pET-GST-SUMO-toxin载体。利用该系统,重组海南毒素I(rHNTX-I)、重组海南毒素IV(rHNTX-IV)、重组虎纹毒素Xa(rHWTX-Xa)等几条毒素在大肠杆菌中获得表达。对rHNTX-IV的电生理活性分析表明,rHNTX-IV的活性与天然毒素一致。另外,我们建立了基于TCA(Trichloroacetic acid)沉淀的亲和层析非依赖的纯化方式。利用毒素多肽与蛋白疏水性的差异,蛋白可以被TCA沉淀下来,而多肽则留在上清,通过反相色谱进一步纯化可以得到高纯度的毒素多肽。实验证明,这种纯化方法适合纯化结构稳定、疏水性较弱的多肽。而对于结构更为复杂或者疏水性较强的多肽并不适用。因此,我们进一步构建了pET-Trx-6×his-SUMO-toxin载体,宿主菌采用Shuffle菌株。通过该系统,我们成功表达了重组6868毒素(r TX-6868)、重组虎纹毒素XVIIa(rHWTX-XVIIa)等毒素。多肽纯化采用比较温和的纯化方式——镍柱亲和层析,融合标签也可以通过再次过镍柱的方式去除。该系统适合表达纯化蛋白和疏水性较强或者含有多对二硫键的多肽。对于一些蛋白或多肽的编码DNA,我们需要通过基因合成来获得。在本文中,我们建立了一种基于单管反向PCR的全基因合成方法,命名为STRP(single-tube reverse PCR)法。这是一种非常简单有效的方法,该方法最大的优势在于,在基因合成的同时可以将该基因构建到质粒载体,省去了繁琐的基因克隆步骤(双酶切、LIC、体外重组等)。目前,采用STRP法,我们成功合成了三条700 bp左右的基因并同时将其构建到表达载体并成功表达。目前构建的最长基因可以达到1400 bp。采用重叠PCR的方法,可以有效地将寡核苷酸引入的突变修复。STRP基因合成法对于异源表达平台是一个有力的补充,可以显著地提高载体改造的效率,缩短异源蛋白表达的周期。综上所述,分子克隆和蛋白/多肽的异源表达与纯化是每个实验室中最基础的技术,这些技术的效率影响着整个项目的进度。本课题对这些方法进行了改进和创新,对于目前常规的实验技术是一个补充,对研究人员有着较为重要的参考价值。