肥胖、Ⅱ型糖尿病、心脑血管疾病和肿瘤等存在密切的相关性,研发防治肥胖及其相关疾病的药物均是重要的研究课题。C/EBP β在前脂肪细胞分化为脂肪细胞过程中起关键作用,C/EBP β基因表达激活C/EBP α,后者激活多个参与脂肪合成的酶系基因(如422/ap2, SCD1,CLU4等)的转录,从而促进脂肪合成,使前脂肪细胞分化为脂肪细胞。首先用软件分析发现C/EBP基因启动子序列富含CpG岛,推测CpG岛的甲基化调控C/EBP β基因的表达.在前脂肪细胞未加入诱导剂时,其启动子CpG岛处于高度甲基化,导致C/EBP β基因表达呈沉默状态;加入诱导剂MDI后,C/EBP β启动子区域CpG岛去甲基化,使C/EBP β基因表现转录活性,诱导前脂肪细胞分化为脂肪细胞。在具体C/EBP β基因启动区域CpG岛甲基化状态检测和Western Blot分析中,观察到这种相关性。显示C/EBP β基因启动区域CpG岛的甲基化状态调控C/EBP β基因表达,在调控前脂肪细胞分化为脂肪细胞过程中起重要作用。在第一个去甲基位点前发现一个潜在的GATA-2蛋白结合位点,通过不同的时效曲线也观察到GATA-2和C/EBP β表达存在负相关,说明GATA-2一定程度上调控C/EBPp的表达。进一步用Molecular Dock计算机对接软件得出：GATA-2蛋白可以结合到C/EBP β基因启动子上的结合位点。地黄具有较高的药用价值,为四大淮药之一。我们的研究表明,地黄提取液能抑制脂肪细胞分化和降低饮食性肥胖大鼠的高血糖和高血脂。同时地黄提取液可以在6天的时候较大程度抑制C/EBP β蛋白的表达,但在24小时并没有明显地抑制其表达,说明地黄提取液可能不是通过抑制C/EBP β基因启动子区域CpG去甲基化,从而使得C/EBP β基因表达降低；但是RE可以显著提高GATA-2在前脂肪细胞诱导后1-4天时的表达水平,结合它抑制C/EBP β基因表达的作用,推断RE抑制前脂肪细胞分化的机理可能与GATA-2途径有关,与黄连素的作用相似。1、C/EBPβ基因表达水平的检测为通过Western Blot的方法检测C/EBP P的表达水平,我们制备C/EBP β的抗血清。首先克隆C/EBP β的cDNA基因片段,与Ply4载体重组,经温度诱导,表达产物大部分形成包涵体,经初步纯化后作为抗原免疫家兔制备C/EBP β的抗血清。抗血清对C/EBP β蛋白有识别作用。用此抗血清检测前脂肪细胞分化过程中不同时间点C/EBP β的表达水平,结果显示：C/EBP β的在加入诱导剂后即开始表达,在1天时表达水平达到最高,从而引起C/EBP α蛋白的表达,促进前脂肪细胞分化。在诱导24小时后C/EBP β表达量逐步降低。2、前脂肪细胞分化与C/EBP β基因启动子区CpG岛甲基化的关系用软件分析C/EBP β的基因序列时发现,该基因启动位点ATG之前约-3000bp富含GC,存在多个CpG岛。传统理论认为CpG岛中C的甲基化状态影响下游基因表达,甲基化程度越高,下游基因表达水平越低,反之,基因表达水平越高。采用BSP-PCR方法检测前脂肪细胞分化前后该段序列的CpG岛甲基化状态变化情况,亚硫酸盐测序法将DNA分子中的胞嘧啶(C)转化为尿嘧啶(T),然后经PCR扩增基因片段并检测基因顺序变化的情况,分析基因位点是否存甲基化。结果显示：前脂肪细胞分化前后72小时内C/EBP β基因表达变化是在诱导后24小时C/EBP β基因表达水平最高,然后逐步降低,所以检测C/EBP β基因启动子在24小时的甲基化情况,结果表明在24小时:C/EBP β基因启动区域共有7个CpG位点呈甲基化状态,其中的2个甲基化位点在加入诱导剂后发生去甲基化现象,同时C/EBP β基因从沉默到高水平表达,表明CpG岛去甲基化在调控C/EBP β基因表达以及前脂肪细胞的诱导分化过程中起重要作用。在前脂肪细胞(3T3-L1cells)分化前后加入5一氮杂-2一脱氧胞苷(AZA,又名地西他滨decitabine)观察其对C/EBP β基因表达的影响。AZA是阿扎胞苷脱氧核糖类似物,甲基化转移酶的抑制剂。结果显示：AZA并没有提高C/EBP β基因表达量,相反却降低其表达,表明C/EBP β基因启动子区域CpG岛的甲基化可能是保守存在的,而不是通过甲基化转移酶修饰而成的,而AZA可能具有去甲基化作用,但由于有多种去甲基化的途径,AZA具体作用机理有待进一步研究。在分析C/EBP β基因启动子CpG岛顺序时发现,其中的一个甲基化位点上游有转录调控因子GATA-2序列结合位点,该甲基化位点在诱导后发生去甲基化现象,所以检测GATA-2和C/EBP β蛋白在前脂肪细胞的分化前后的变化,结果表明两者存在负相关,即在加入诱导剂后GATA-2表达量迅速降低,而C/EBP β蛋白立即大量表达。通过计算机模拟对接发现GATA-2蛋白可以结合到C/EBP β基因启动子的甲基化位点,当GATA-2蛋白结合到该甲基化位点时,阻止该位点发生去甲基化,加入诱导剂后,GATA-2蛋白表达量迅速降低,该甲基化位点失去保护作用而去甲基化,从而C/EBP β蛋白开始表达。3、生地黄提取液对大鼠饮食性肥胖的抑制作用及其对前脂肪细胞分化过程中C/EBPp基因启动子区CpG岛甲基化的影响采用高效液相色谱—质谱联用(HPLC-MS)技术,通过在反相C18色谱柱上进行分离和在线检测对应色谱峰的分子量,将地黄提取物分段收集得Hx-H17共18个组分,只有Hx组分显著抑制前脂肪细胞分化,但只有整个地黄提取液(RE)的50%,可能是因为地黄中Hx与其他组分存在协同作用。用3T3-L1前脂肪细胞分化模型和高脂饮食诱导幼年肥胖大鼠模型研究生地黄提取液对脂肪细胞分化和饮食性肥胖的抑制作用,Western Blot实验显示生地黄提取液抑制脂肪细胞分化过程中关键的转录因子C/EBP β的表达。生地黄提取液对幼年大鼠饮食性肥胖的研究结果显示：体重、体重指数和脂肪组织的重量降低,并有降脂和降血糖等作用。分析生地黄提取液对前脂肪细胞分化过程中C/EBP β启动子区域CpG岛甲基化状态的影响,研究结果显示：地黄提取液(2mg/ml)与前脂肪细胞诱导分化剂同时加入24小时后,C/EBP β基因表达水平没有明显下降,但是在4天时C/EBP β基因表达下降,地黄提取液可能通过C/EBP β基因启动区域CpG岛去甲基化以外的途径实现对C/EBP β基因表达和前脂肪细胞分化的抑制作用。同时在分析生地黄提取液RE对GATA-2基因表达的水平的影响时,结果显示：RE可以显著提高1-4天时GATA-2蛋白的表达水平,根据GATA-2具有抑制C/EBP β基因表达的作用,推断RE抑制前脂肪细胞分化的机理可能与黄连素相似,可能是通过GATA-2途径降低C/EBP β基因表达。