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本研究运用RT-PCR技术,从泌乳母猪乳腺组织中克隆了猪乳铁蛋白(PLF)基因,采用杆状病毒-昆虫表达系统在家蚕蛹中表达了重组猪乳铁蛋白(rPLF),研究了表达产物rPLF的体外抗菌效果、rPLF对断奶仔猪生长性能、免疫功能、肠道菌群和小肠形态以及抗菌肽基因表达的影响。主要研究结果如下: 1.采用RT-PCR技术,先从泌乳15天的大约克母猪乳腺组织中分两片段克隆出PLF的基因,然后再通过两片段拼接的方法克隆出全长PLF基因,电泳分析显示,其条带分子量大小与理论分子量(2115bp)相符,测序结果表明,其核苷酸序列与Genebank报道的目的基因(登录号:L77887)的同源性达99%,证实已正确克隆PLF目的基因。 2.构建了PLF基因的重组病毒转移载体pBlueBacHisC-PLF,通过同源重组的方法构建了PLF基因重组杆状病毒,在Sf9细胞中繁殖,并感染家蚕蛹;SDS-PAGE检测结果表明,蚕蛹细胞裂解产物中有一分子量为80kD左右的特异性条带,进一步进行western blot检测,在特异性条带对应位置也有相应条带,且特异性条带的分子量也在80kD左右,结果显示,PLF基因在家蚕蛹内得到了表达。 3.通过Time-kill方法,研究了含rPLF蚕蛹和经胃蛋白酶水解的含rPLF蚕蛹的体外1、2、4、8、16和24小时的抗菌效果。研究表明,空白对照蚕蛹在4小时没有表现出抗菌活性,直到16小时才表现出一定的抗菌活性;而含rPLF蚕蛹从2小时就表现出了抗菌肽活性,4小时、8小时、16小时和24小时的抗菌活性明显高于空白对照蚕蛹(P<0.01)。空白对照蚕蛹经胃蛋白酶水解后,与未被水解的空白对照蚕蛹相比,两者抗菌活性没有发生明显差异:但含rPLF蚕蛹经胃蛋白酶水解后。其抗菌活性比未被酶解的含rPLF蚕蛹有显著提高(P<0.01)。 4.通过90头28日龄断奶的平均体重在6.13kg左右杜长嘉仔猪(公母各半)30天的饲养试验,结果表明,饲粮中添加rPLF比对照组(不添加rPLF)腹泻率降低了24.85%(P<0.01),日增重提高了34.04(P<0.01),料重比降低了12.83%(P<0.05);通过90头28日龄断奶的平均体重在7.05kg左右的杜长大仔猪(公母各半)断奶后1-15天(断奶前期)和16-30天(断奶后期)的分阶段饲养试验,结果表明,在断奶前期,饲粮中添加rPLF比对照组腹泻率降低了66.25%(P<0.01),日增重提高了41.84%(P<0.01),料重比降低了14.78%(P<0.05);在断奶后1-30天,饲粮中添加rPLF比对照组腹泻率降低丁75.20%(P<0.01),日增重提高了15.19%(P>0.05),料重比降低了12.74%(P>0.05);从本研究结果揭示,rPLF有较好的抗断奶仔猪腹泻效果,在提高浙江大学博士学位论文:中英文摘要 日增重和降低料重比的效果上,在断奶前期的效果优于断奶后期。5.杜长嘉断奶仔猪饲养30天后,各处理组取3头体重相近小母猪进行屠宰,取血 样分离血清,进行T一淋巴细胞转化实验、免疫球蛋白测定、及IL一1和IL一2以及 血清铁和总铁结合力的分析;取脾脏,进行细胞培养,研究脾脏淋巴细胞在PHA 和ConA诱导下的增殖率。结果表明,与对照组相比,rPLF提高了仔猪血清中 T一淋巴细胞转化率47.19%(P<0 .01);分别提高了由PHA和ConA诱导的脾淋 巴细胞增殖率116.90%(P<0 .01)和89.08%(P<0 .01);提高了血清中IgG水平 10.99%(尸<0.05),IgA水平20.00%(尸<0.05),IgM水平22.64%(尸<0.05);提 高了血清中IL一2的水平46.64%(尸<0.01)。分别在杜长大断奶仔猪饲养第15天 和第30天,各处理组取3头体重相近小母猪进行屠宰,取血样和脾脏,进行相 关指标测定与分析,研究结果表明,rPLF均显著提高了杜长大仔猪血清中T一淋 巴细胞转化率(P<0,01)、脾淋巴细胞增掖率(P<0 .01)、IgG和IgA水平(尸<0.05) 以及IL一2的水平(P<0.05)。:PLF都显著提高了仔猪血清中铁的水平(P<0.05)。6.杜长大断奶仔猪饲养第15天后,各处理组取3头体重相近的小母猪进行屠宰, 取结肠内容物,进行肠道菌群分析,取十二指肠和空肠,制电镜切片,观察小肠 绒毛隐窝的变化。肠道菌群结果表明,在对致病菌影响上,饲粮添加rPLF减少 大肠杆菌的生长34.6%(只0.05),减少沙门氏菌的生长57.4%(只0.05);在对有 益菌的影响上,添加rPLF可以增加乳酸菌的数量72.1%(只0.05),增加双歧 杆菌的数量143%(只0.01)。电镜切片结果分析表明,与对照组相比,rPLF组明 显改善了仔猪十二指肠和空肠的绒毛高度和密度。7.杜长大断奶仔猪在饲养第15和第30天后,各处理组分别取3头体重相近的小母 猪进行屠宰,取骨髓,克隆抗菌肤pR一39和Protegrin一l基因,采用RT一PeR法 研究饲粮添加:PLF对断奶仔猪骨髓抗菌肤基因表达的影响。研究结果表明,与 对照组比,在28日龄断奶的杜长大仔猪断奶后卜巧天饲喂rPLF均显著提高仔 猪骨髓抗菌肤pR一39和Protegrin一1的基因表达,分别提高了143%(只0.01) 和217%(只0.01)。对断奶16一 30天仔猪的抗菌肤PR一39和Protegrin一1的基因 表达也有增强的趋势,但没有产生显著水平(乃0.05)。结果揭示rPLF促进断奶 仔猪非特异性免疫因子抗菌肚发育上存在阶段性差异,在断奶前期优于断奶后 期。