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本研究运用RT-PCR技术，从泌乳母猪乳腺组织中克隆了猪乳铁蛋白(PLF)基因，采用杆状病毒-昆虫表达系统在家蚕蛹中表达了重组猪乳铁蛋白(rPLF)，研究了表达产物rPLF的体外抗菌效果、rPLF对断奶仔猪生长性能、免疫功能、肠道菌群和小肠形态以及抗菌肽基因表达的影响。主要研究结果如下： 1．采用RT-PCR技术，先从泌乳15天的大约克母猪乳腺组织中分两片段克隆出PLF的基因，然后再通过两片段拼接的方法克隆出全长PLF基因，电泳分析显示，其条带分子量大小与理论分子量(2115bp)相符，测序结果表明，其核苷酸序列与Genebank报道的目的基因(登录号：L77887)的同源性达99％，证实已正确克隆PLF目的基因。 2．构建了PLF基因的重组病毒转移载体pBlueBacHisC-PLF，通过同源重组的方法构建了PLF基因重组杆状病毒，在Sf9细胞中繁殖，并感染家蚕蛹；SDS-PAGE检测结果表明，蚕蛹细胞裂解产物中有一分子量为80kD左右的特异性条带，进一步进行western blot检测，在特异性条带对应位置也有相应条带，且特异性条带的分子量也在80kD左右，结果显示，PLF基因在家蚕蛹内得到了表达。 3．通过Time-kill方法，研究了含rPLF蚕蛹和经胃蛋白酶水解的含rPLF蚕蛹的体外1、2、4、8、16和24小时的抗菌效果。研究表明，空白对照蚕蛹在4小时没有表现出抗菌活性，直到16小时才表现出一定的抗菌活性；而含rPLF蚕蛹从2小时就表现出了抗菌肽活性，4小时、8小时、16小时和24小时的抗菌活性明显高于空白对照蚕蛹(P<0.01)。空白对照蚕蛹经胃蛋白酶水解后，与未被水解的空白对照蚕蛹相比，两者抗菌活性没有发生明显差异：但含rPLF蚕蛹经胃蛋白酶水解后。其抗菌活性比未被酶解的含rPLF蚕蛹有显著提高(P<0.01)。 4．通过90头28日龄断奶的平均体重在6.13kg左右杜长嘉仔猪(公母各半)30天的饲养试验，结果表明，饲粮中添加rPLF比对照组(不添加rPLF)腹泻率降低了24.85％(P<0.01)，日增重提高了34.04(P<0.01)，料重比降低了12.83％(P<0.05)；通过90头28日龄断奶的平均体重在7.05kg左右的杜长大仔猪(公母各半)断奶后1-15天(断奶前期)和16-30天(断奶后期)的分阶段饲养试验，结果表明，在断奶前期，饲粮中添加rPLF比对照组腹泻率降低了66.25％(P<0.01)，日增重提高了41.84％(P<0.01)，料重比降低了14.78％(P<0.05)；在断奶后1-30天，饲粮中添加rPLF比对照组腹泻率降低丁75.20％(P<0.01)，日增重提高了15.19％(P>0.05)，料重比降低了12.74％(P>0.05)；从本研究结果揭示，rPLF有较好的抗断奶仔猪腹泻效果，在提高浙江大学博士学位论文:中英文摘要 日增重和降低料重比的效果上，在断奶前期的效果优于断奶后期。5.杜长嘉断奶仔猪饲养30天后，各处理组取3头体重相近小母猪进行屠宰，取血 样分离血清，进行T一淋巴细胞转化实验、免疫球蛋白测定、及IL一1和IL一2以及 血清铁和总铁结合力的分析;取脾脏，进行细胞培养，研究脾脏淋巴细胞在PHA 和ConA诱导下的增殖率。结果表明，与对照组相比，rPLF提高了仔猪血清中 T一淋巴细胞转化率47.19%(P<0 .01);分别提高了由PHA和ConA诱导的脾淋 巴细胞增殖率116.90%(P<0 .01)和89.08%(P<0 .01);提高了血清中IgG水平 10.99%(尸<0.05)，IgA水平20.00%(尸<0.05)，IgM水平22.64%(尸<0.05);提 高了血清中IL一2的水平46.64%(尸<0.01)。分别在杜长大断奶仔猪饲养第15天 和第30天，各处理组取3头体重相近小母猪进行屠宰，取血样和脾脏，进行相 关指标测定与分析，研究结果表明，rPLF均显著提高了杜长大仔猪血清中T一淋 巴细胞转化率(P<0，01)、脾淋巴细胞增掖率(P<0 .01)、IgG和IgA水平(尸<0.05) 以及IL一2的水平(P<0.05)。:PLF都显著提高了仔猪血清中铁的水平(P<0.05)。6.杜长大断奶仔猪饲养第15天后，各处理组取3头体重相近的小母猪进行屠宰， 取结肠内容物，进行肠道菌群分析，取十二指肠和空肠，制电镜切片，观察小肠 绒毛隐窝的变化。肠道菌群结果表明，在对致病菌影响上，饲粮添加rPLF减少 大肠杆菌的生长34.6%(只0.05)，减少沙门氏菌的生长57.4%(只0.05);在对有 益菌的影响上，添加rPLF可以增加乳酸菌的数量72.1%(只0.05)，增加双歧 杆菌的数量143%(只0.01)。电镜切片结果分析表明，与对照组相比，rPLF组明 显改善了仔猪十二指肠和空肠的绒毛高度和密度。7.杜长大断奶仔猪在饲养第15和第30天后，各处理组分别取3头体重相近的小母 猪进行屠宰，取骨髓，克隆抗菌肤pR一39和Protegrin一l基因，采用RT一PeR法 研究饲粮添加:PLF对断奶仔猪骨髓抗菌肤基因表达的影响。研究结果表明，与 对照组比，在28日龄断奶的杜长大仔猪断奶后卜巧天饲喂rPLF均显著提高仔 猪骨髓抗菌肤pR一39和Protegrin一1的基因表达，分别提高了143%(只0.01) 和217%(只0.01)。对断奶16一 30天仔猪的抗菌肤PR一39和Protegrin一1的基因 表达也有增强的趋势，但没有产生显著水平(乃0.05)。结果揭示rPLF促进断奶 仔猪非特异性免疫因子抗菌肚发育上存在阶段性差异，在断奶前期优于断奶后 期。